伴有熱性驚厥和智能障礙的癲癇患者的SCN3A基因突變及其功能研究.pdf

1、研究背景：
　　癲癇是一組由腦部神經(jīng)元高度同步化異常放電所致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。電壓門控鈉離子通道是神經(jīng)電活動(dòng)的基礎(chǔ)，其結(jié)構(gòu)和功能的異?？蓪?dǎo)致細(xì)胞膜興奮性改變，在癲癇的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。哺乳動(dòng)物的電壓門控鈉通道由一個(gè)α亞基和一到兩個(gè)β亞基組成，α亞基是鈉通道的功能性單位。SCN1A基因突變已經(jīng)廣泛見于各種類型的癲癇疾病中，尤其與熱性驚厥相關(guān)性癲癇關(guān)系最為密切。SCN3A和 SCN1A基因同樣都在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)，而且亞細(xì)胞

2、定位類似，都分布于細(xì)胞胞體和樹突，但到目前為止只有5例 SCN3A基因突變被報(bào)道與兒童局灶性癲癇相關(guān)聯(lián)，SCN3A突變是否與更多類型的癲癇相關(guān)，尤其是與熱性驚厥相關(guān)還不清楚。SCN3A基因在成年的人和大鼠的腦中表達(dá)有很大差異，而且在SCN1A基因敲除鼠海馬神經(jīng)元中SCN3A表達(dá)上調(diào)，部分補(bǔ)償了SCN1A功能的缺陷；已有多項(xiàng)研究表明2號(hào)染色體上包含了SCN3A基因的大片段缺失與智能障礙相關(guān)，因此我們推測SCN3A基因可能也與人類的高級(jí)精神

3、活動(dòng)有關(guān)。
　　【研究目的】
　　旨在闡述SCN3A突變與熱性驚厥以及智能障礙的關(guān)系，以及探討導(dǎo)致癲癇的發(fā)病機(jī)制，我們?cè)赟CN1A突變陰性的伴有熱性驚厥的、伴或不伴智能障礙的癲癇患兒中篩查SCN3A，并且對(duì)發(fā)現(xiàn)的突變從電生理的角度進(jìn)行功能研究。
　　【實(shí)驗(yàn)方法】
　　1.臨床篩查
　　我們對(duì)148例SCN1A突變陰性的伴有熱性驚厥的癲癇患兒中進(jìn)行SCN3A篩查，按有無智能障礙分為兩個(gè)亞組，比較他們突變率的差

4、別，并且總結(jié)了突變病人的臨床特性；對(duì)于發(fā)現(xiàn)的突變點(diǎn)做了父母親的對(duì)照以確定突變來源，并設(shè)立了正常人對(duì)照以排除多態(tài)性位點(diǎn)。
　　2.質(zhì)粒構(gòu)建及擴(kuò)增
　　以含有SCN3A基因的mRNA序列的質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)帶突變點(diǎn)的引物，對(duì)發(fā)現(xiàn)的突變點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建，成功構(gòu)建后進(jìn)行擴(kuò)增。
　　3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染及表達(dá)
　　質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48h后，分別通過RT-PCR和Western-blot檢測目的基因和蛋白的表達(dá)，并且將各突變型與

5、野生型表達(dá)的差異進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。
　　4.膜片鉗記錄
　　使用全細(xì)胞膜片鉗記錄技術(shù)闡述各突變體的生物物理特性，并各自與野生型通道進(jìn)行比較。我們觀察的指標(biāo)有：電流密度、持續(xù)性鈉電流、激活、快速失活、快失活恢復(fù)、慢速失活、慢失活恢復(fù)等。
　　5．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　采用SPSS13.0軟件包、Excel2003和Stata10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤( X±SE)表示，組間比較采用兩樣本 t檢驗(yàn)。電生理

6、學(xué)結(jié)果使用OriginPro8.0軟件擬合和作圖。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　【研究結(jié)果】
　　1.臨床篩查
　　我們?cè)诎橛兄悄苷系K的病人組中發(fā)現(xiàn)了4例新的SCN3A突變，做了206例正常人對(duì)照沒有發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的突變，這些突變來源于4例表型不同的病人，診斷分別是熱性驚厥附加癥、全面性癲癇伴熱性驚厥附加癥、重癥嬰兒肌痙攣性癲癇和Lennox-Gaust綜合征。3例病人有孤獨(dú)癥，發(fā)病時(shí)間越早的癲癇癥狀越重。

7、　　2.質(zhì)粒構(gòu)建
　　通過酶切和測序證實(shí)，我們成功構(gòu)建了4個(gè)SCN3A基因突變體質(zhì)粒。
　　3.異源表達(dá)的鑒定
　　野生型和各突變體鈉通道在基因和蛋白水平上都得到了表達(dá)，但各突變型與野生型比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4.膜片鉗檢測
　　所有突變體表現(xiàn)出可測量的鈉電流，與野生型相比較，每個(gè)突變體呈現(xiàn)了不同的生物物理特性。N302S的電壓依賴性激活和快速失活都向去極化方向漂移，激活比快速失活移動(dòng)更明顯，二者所圍成的

8、窗口下面積減小，延長了慢失活恢復(fù)時(shí)間，提示鈉通道功能減弱；A463V顯示峰值鈉電流密度和峰值持續(xù)性鈉電流比野生型增大，提示鈉通道功能增強(qiáng)；R520T呈現(xiàn)了電壓依賴性快失活向去極化移動(dòng)，激活無明顯變化，但與快失活所圍成的窗口下面積增大，縮短了慢失活的恢復(fù)時(shí)間，提示通道功能增強(qiáng)；D998E顯示了電壓依賴性激活向去極化方向漂移，而慢速失活向超極化方向漂移，但是持續(xù)性鈉電流增大，呈現(xiàn)了混合型的鈉通道功能改變。
　　【結(jié)論】
　　1.