Brugada綜合征SCN5A基因突變G1712C的功能表達(dá)研究.pdf

1、Brugada綜合征(Brugada syndrome，BrS)是一種罕見(jiàn)的遺傳性心律失常綜合征，具有心電圖表現(xiàn)為右胸導(dǎo)聯(lián)V1-V3持續(xù)性ST段抬高和高心源性猝死(sudden cardiac death，SCD)風(fēng)險(xiǎn)特征。本病因發(fā)生暈厥或心源性猝死概率高，且與青壯年猝死高度相關(guān)而日益引起人們的重視。典型心電圖表現(xiàn)為右胸前導(dǎo)聯(lián)（V1-V3）ST段抬高≥2 mm，可繼發(fā)T波倒置，而QT間期正常。發(fā)作時(shí)心電圖表先為極短配對(duì)間期室性期前收縮、

2、多形室速、室顫，而體格檢查和輔助檢查（胸片、心臟彩超、心臟MRI等）均無(wú)心臟器質(zhì)性病變證據(jù)。Brugada綜合征的流行病學(xué)特征目前尚無(wú)明確資料，但亞洲和東南亞國(guó)家明顯高于其他國(guó)家，達(dá)0.5/1000-1/1000。在亞洲的某些地區(qū)，Brugada綜合征是導(dǎo)致50歲以下青年男性自然死亡的最常見(jiàn)原因。近年的相關(guān)研究表明，Brugada綜合征的發(fā)病機(jī)制與許多基因突變密切相關(guān)，尤其是編碼人類心臟鈉通道α亞單位的SCN5A基因的突變，其機(jī)理可能是

3、SCN5A基因的突變導(dǎo)致心臟鈉通道蛋白的功能障礙。
　　目的:
　　為進(jìn)一步探討B(tài)rugada綜合征離子、細(xì)胞電生理的發(fā)病機(jī)制，本研究擬通過(guò)對(duì)本課題組前期發(fā)現(xiàn)的Brugada綜合征基因SCN5A新突變G1712C進(jìn)行功能表達(dá)研究。
　　方法:
　　分兩部分進(jìn)行，第一部分:對(duì)含有相關(guān)SCN5A基因(G1712C)突變片段采用定點(diǎn)誘變PCR進(jìn)行擴(kuò)增，HindⅢ和XbaⅠ酶進(jìn)行質(zhì)粒酶切鑒定法構(gòu)建質(zhì)粒，DNA序列測(cè)定來(lái)鑒

4、定定點(diǎn)誘變是否成功。
　　第二部分:先應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法得到穩(wěn)定表達(dá)的hβ1細(xì)胞系，然后再將hβ1細(xì)胞分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至野生型、突變型兩種質(zhì)粒。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后于37℃恒溫箱中孵育48小時(shí)，然后再取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞分別進(jìn)行膜片鉗檢測(cè)。構(gòu)建pcDNA3.1-GFP-SCN5A突變體質(zhì)粒，通過(guò)脂質(zhì)體Lipofectamine3000分別將pcDNA3.1-GFP和pcDNA3.1-GFP-SCN5A突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HEK293細(xì)胞中，轉(zhuǎn)

5、染36小時(shí)后再在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，然后激光共聚焦顯微鏡(leicaTCS SP8)下觀察綠色熒光蛋白在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的分布情況。
　　結(jié)果:
　　成功構(gòu)建了含有SCN5A基因突變G1712C的pcDNA3.1(mpcDNA3.1)表達(dá)重組體。在激光共聚焦顯微鏡下，觀察到GFP-SCN5A突變體(G1712C)主要在細(xì)胞質(zhì)的外周（細(xì)胞膜）中分布，突變位點(diǎn)成功定位到了細(xì)胞膜上。在野生型pcDNA3.1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中，指令電