全身性癲癇伴熱性驚厥附加癥(GEFS+)的GABRG2和SCN1B基因突變及cSNP篩查.pdf

1、癲癇(epilepsy)是多種病因?qū)е碌穆阅X疾病,是大腦神經(jīng)元過度放電引起陣發(fā)性、暫時性腦功能障礙的臨床表現(xiàn),是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。癲癇的發(fā)病率約為4-7％0,癲癇的臨床分類有多種。全面性癲癇伴熱性驚厥附加癥(generalized epilepsy with febrile seizures plus,GEFS+)是2001年國際抗癲癇聯(lián)盟新命名的一種癲癇綜合征。
　　 全面性癲癇伴熱性驚厥附加癥是臨床上常見的、具有

2、代表性的遺傳性癲癇綜合征,其臨床特征為高熱驚厥家系中的患兒在6歲以后仍有高熱驚厥或伴有無熱驚厥,或兼有其他發(fā)作形式的癲癇綜合征。臨床表現(xiàn)復雜,類型多種,頻繁的癲癇發(fā)作嚴重地威脅到患者的生命,因此,尋找有效的診斷方法,探討發(fā)病機制,對有效的控制癲癇發(fā)作有重要的價值。
　　 國外研究顯示全面性癲癇伴熱性驚厥附加癥是常染色體顯性遺傳,具有顯著的表型異質(zhì)性和遺傳異質(zhì)性。同一個家系中受累成員的臨床表型可不同,Scheffer首次報道GEF

3、S+的大家族中,其核心家庭符合常染色體顯性遺傳,外顯率為89％。Singh對9個GEFS+家庭的家系分析也表明為常染色體顯性遺傳,外顯率約為50％～60％。由于有不完全外顯率導致臨床的各種表型及一些沒有臨床癥狀的被動攜帶者,Singh等主張以復雜性多基因遺傳來解釋GEFS+表型異質(zhì)性的特性。GEFS+的發(fā)作形式具有豐富的異質(zhì)性,是一種多形的家族性癲癇綜合征,目前尚缺乏具體流行病學依據(jù)。最常見的表型是熱性驚厥(febrile seizur

4、es,FS)；其次是熱性驚厥附加癥(febrile seizures plus,FS+)。GEFS+一般呈良性經(jīng)過,智力運動發(fā)育正常,大多在25歲前或兒童后期停止發(fā)作。
　　 近年來,國外對GEFS+突變基因的研究取得了較大進展,發(fā)現(xiàn)多為離子通道編碼基因突變所致,目前國外已報道了5個與GEFS+相關的基因-SCN1B(電壓門控鈉離子通道β1亞單位基因)、SCN1A(電壓門摔性鈉通道α1亞基基因)、SCN2A(電壓門控鈉離子通道α

5、2亞基基因)、GABR G2(A型GABA受體γ亞基基因)和GABRD(A型GABA受體δ亞基基因)。
　　 (1)SCN1B突變與GEFS+:1998年Wallace等首先對一GEFS+大的澳大利亞家系進行連鎖分析,發(fā)現(xiàn)一C121W的錯義突變,Scheffer等在4個癲家系中發(fā)現(xiàn)了SCN1B突變,其中2個新的家系突變位點為原來已報道的(C121W),另外兩個位點為R85C和R85H突變。(2)SCN1A突變與GEFS+:α亞單

6、位編碼的SCN1A是GEFS+最重要的基因。Annesi等對9個意大利GEFS+家系通過SSCP進行突變篩查,最后在其中兩個家系中發(fā)現(xiàn)了2個SCN1A的異常突變,第一個突變是A2336G；第二個突變是T5522C。Spampanto等在對一GEFS+的意大利家系研究中證實了SCN1A的另一突變位點D1866Y,Audenaert等對一GEFS+家系進行連鎖分析,把致病基因定位在2p24上。Pineda-Trujjllo等對一GEFS+南

7、美大家系的研究中發(fā)現(xiàn)G1742D的突變,Nagao等也報告了一GEFS+家系,在患者中發(fā)現(xiàn)了一SCNIA的錯義突變(G5569T)。Barela等在一高加索GEFS+家系中又證明了SCN1A另一異常突變(R859C)。(3)SCN2A突變與GEFS+:Sugawara等在2001年首次對GEFS+患者中鈉通道α2亞基編碼的SCN2A進行篩奄,發(fā)現(xiàn)一個在進化上非常保守的位點,即R187W突變,一SCN2A的截斷突變在一類似SMEI的難治性

8、癲癇中得到證實。(4)GABAA突變與GEFS+:Baulac等在一個類似GEFS+的家系中,發(fā)現(xiàn)γ2亞單位的一個突變(K289M)。Wallace等在一個有兒童失神性癲癇和熱性驚厥的家系中發(fā)現(xiàn)γ2亞單位另一突變(R43Q)。2006年,GEFS+家系中又有2個新的位點被發(fā)現(xiàn),即E177A和R220H。2004年,Dibbens等在一澳大利亞家系中發(fā)現(xiàn)GABRD突變,該突變編碼GABAA受體δ亞單位。黃希順等收集到的7個GEFS+家系對

9、GABRA6進行篩查,末發(fā)現(xiàn)相關突變。Bonanni等收集了7個GEFS+家系,在其中4個家系中GABRG2基因編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)了單核苷酸的多態(tài)性,該研究證明了GEFS+的遺傳和表型異質(zhì)性。張守山等對一個GEFS+家系GABRB2編碼區(qū)全部11個外顯子進行測序分析,結(jié)果在患者GABRB2基因外顯子2第133個堿基處發(fā)現(xiàn)一新的C/G多態(tài)性。此外Audenaert D等報道的1個比利時四代大家系發(fā)現(xiàn)一新定位在2p24,但其致病基因尚未明確。

10、>　　 盡管目前遺傳學研究已取得明顯進展,但已知的GEFS+基因突變僅存在于少數(shù)家系中,大多數(shù)GEFS+家系的致病基因仍有待更多的發(fā)現(xiàn)。鑒于目前國內(nèi)外對此病的研究狀況,為進一步了解GEFS+的發(fā)病機制,本研究擬采用PCR產(chǎn)物直接測序法對9個家系共有109名成員的GABRG2及SCN1B基因的全部外顯子進行突變篩查,尋找中國人群GEFS+的致病基因,探索GEFS+患者GABRG2及SCN1B基因是否有突變,闡明中國人群GEFS+發(fā)病的分

11、子機制。
　　 [對象和方法]
　　 1.對象:9例先證者于2002年1月至2009年12月期間就診于廣東省人民醫(yī)院兒科癲癇?？崎T診,均為漢族,全部來自廣東。9例先證者按照2001年國際抗癲癇聯(lián)盟(ILAE)對癲癇及癲癇綜合癥分類診斷標準被確認為GEFS+后,我們采用統(tǒng)一制定咨詢表格,通過門診和家庭訪視等方式對家系成員調(diào)查訪問,嚴格按照國家法規(guī)取得患者及家屬同意后,完善臨床資料收集和抽取血樣。收集到9個家系共109名成員

12、接受調(diào)查(4名已過世,病史由親屬提供),抽取到血液樣本105例。對照組:在本院體檢中心隨機選取健康人200例納入對照組,均為漢族,性別、年齡均與患者組相匹配,各項檢查均未見異常。
　　 2.臨床資料收集:全部患者均完善視頻長程腦電圖、頭部MRI檢查,建立GEFS+病人資料庫,制定和采用統(tǒng)一的調(diào)查表和方法,進行家系調(diào)查、資料收集和處理。
　　 3.GABRG2及SCN1B基因突變篩查:
　　 (1)全部家系成員(共

13、105例)及200例健康對照人群均抽取200 μl外周靜脈血液,提取基因組DNA。
　　 (2)根據(jù)GABRG2及SCN1B基因組標準序列,設計擴增全部外外顯子的PCR引物,全部病例標本采用PCR特異性擴增GABRG2基因的1～9號及SCN1B基因的1～5號外顯子片段。
　　 (3)對PCR產(chǎn)物進行純化,采用ABI3730測序儀進行測序。應用Vector NTI 8.0分析軟件分析測序結(jié)果,并與GenBank中的標準序列

14、進行比對,確定可能的突變位點后,擴增200例健康對照組相關基因片斷進行比對,確定新發(fā)現(xiàn)的突變點,除外基因的多態(tài)性。如確定為突變位點,則采用上述方法對先證者家族成員進行突變篩查。
　　 [結(jié)論]
　　 1.本文收集的9個家系中,其臨床表型以FS、FS+為主要類型,還包括少數(shù)FS+伴失神發(fā)作、FS+伴肌陣攣發(fā)作、FS+伴局灶性發(fā)作以及特發(fā)性全面性癲癇。充分體現(xiàn)了GEFS+的表型異質(zhì)性。
　　 2.我們對所有105例G

15、EFS-家系成員(其中忠者34例)進行GABRG2及SCN1B基因的全部外顯子的PCR擴增及測序工作,結(jié)果未發(fā)現(xiàn)已報道的GABRG2熱點突變(K289M、R43Q、Q351X)及SCN1B熱點突變(C121W、170 E74del、R85C、R85H)。提示GABRG2很可能不是中國南粵地區(qū)GEFS+的主要致病基因。進一步證實了GEFS+具有明顯的遺傳異質(zhì)性。
　　 3.在GEFS+的GABRG2cDNA序列上發(fā)現(xiàn)了編碼區(qū)起始密

16、碼子前第-14號核苷酸A的缺失變異,該變異在本研究全部GEFS+患者及大部分健康對照者中均存在,我們認為該變異可能是我國人群高頻出現(xiàn)的單核苷酸多肽,并非GEFS+致病的潛在因素。
　　 4.在奉研究家系Ⅰ的三代男性共5名成員中均發(fā)現(xiàn)SCN1B的雜合錯義突變H223D,位于第3號外顯子,該突變導致組氨酸被天門冬氨酸替代,這提示SCN1B很可能是中國南方人群GEFS+患者的致病基因,此結(jié)果未在國內(nèi)外報道,很可能是中國南方人群GEFS