關(guān)節(jié)攣縮癥基因突變篩查及致病機(jī)制的初步研究.pdf

1、背景和目的：關(guān)節(jié)攣縮癥（arthrogryposis），又稱多發(fā)性先天攣縮癥（multiple congenital contractures）是指出生后就存在兩個(gè)或者兩個(gè)以上的關(guān)節(jié)發(fā)生先天性多發(fā)關(guān)節(jié)攣縮，通常主要涉及到四肢，但也涉及到下巴，脖子和脊柱等部位。關(guān)節(jié)攣縮癥是一種臨床癥狀，而不是一種臨床疾病。這種攣縮癥狀通常是非進(jìn)行性的，如果在早期進(jìn)行及時(shí)合理的物理治療和護(hù)理可以改善病人的臨床癥狀?？傮w上講，關(guān)節(jié)攣縮癥的發(fā)生主要原因是因?yàn)樵?/p>

2、胎兒懷孕期間由于中心神經(jīng)疾病，外周神經(jīng)疾病，肌肉疾病，結(jié)締組織疾病，胎兒空間缺乏，母體疾病，環(huán)境因素和血管損傷等，導(dǎo)致胎兒胎動(dòng)減少引起的。目前發(fā)現(xiàn)超過(guò)400多種疾病都可能出現(xiàn)關(guān)節(jié)攣縮癥狀，這些疾病包括：基因突變，染色體重排，染色體缺失和重復(fù)等引起的疾病。其中有超過(guò)150多種單基因疾病都會(huì)存在關(guān)節(jié)攣縮癥，因此僅僅通過(guò)臨床癥狀對(duì)于該疾病確診比較困難。雖然關(guān)節(jié)攣縮癥是一種比較少見(jiàn)的臨床癥狀，但臨床上總的發(fā)病率高達(dá)1/3000-1/5000之間

3、，因此一個(gè)明確的診斷對(duì)于該類疾病的再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，患者的管理和疾病治療很重要。
　　方法：收集2014年9月至2016年12月間來(lái)我院進(jìn)行遺傳咨詢的關(guān)節(jié)攣縮癥的病人，進(jìn)行臨床咨詢、放射及超聲影像學(xué)檢查。應(yīng)用全外顯子高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)臨床診斷疑似關(guān)節(jié)攣縮癥的先證者進(jìn)行基因突變篩查，根據(jù)臨床癥狀，進(jìn)行生物學(xué)信息分析，初步確定可能的致病突變位點(diǎn)，采用 Sanger測(cè)序?qū)蚁党蓡T進(jìn)行驗(yàn)證，根據(jù)遺傳學(xué)共分離原則，最終確定家系的致病基因，對(duì)需要產(chǎn)前診

4、斷并且已經(jīng)明確致病突變位點(diǎn)的家系進(jìn)行產(chǎn)前診斷。
　　為了探討關(guān)節(jié)攣縮癥的致病機(jī)制，我們對(duì)其中一個(gè)家系的TNNT3致病基因進(jìn)行功能學(xué)分析。在簽署知情同意書(shū)的情況下，對(duì)該家系引產(chǎn)的關(guān)節(jié)攣縮胎兒進(jìn)行組織樣本采集，采用 HE染色及電子顯微鏡觀察胎兒骨骼肌的肌小節(jié)和肌細(xì)胞的形態(tài)變化。同時(shí)構(gòu)建 TNNT3基因野生型及突變型真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染 HEK293細(xì)胞，24小時(shí)后，采用熒光定量RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)TNNT3基因

5、突變對(duì)表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果：對(duì)收集的8個(gè)關(guān)節(jié)攣縮病例進(jìn)行全外顯子高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)3例與疾病相關(guān)聯(lián)的致病位點(diǎn)，并且為其中的兩個(gè)家庭提供了產(chǎn)前診斷。
　　家系1：該家系共有3名患者，臨床癥狀均表現(xiàn)為雙手關(guān)節(jié)嚴(yán)重?cái)伩s，尺側(cè)偏斜，屈曲指等癥狀，全外顯子組測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)已報(bào)到的熱點(diǎn)突變位點(diǎn)TNNT3基因c.187C>T(p.R63C)，對(duì)其胎兒羊水進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，在懷孕第三次和第四次胎兒都攜帶該致病位點(diǎn)，在簽署知情下進(jìn)行了引產(chǎn)

6、，結(jié)果胎兒的臨床癥狀和先癥者的癥狀相似，都存在手部遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)攣縮，屈曲指，扁平足等異常。同時(shí)我們收集了胎兒引產(chǎn)的肌肉組織標(biāo)本，在病理水平上發(fā)現(xiàn)，胎兒骨骼肌結(jié)構(gòu)發(fā)生異常改變，尤其是電子顯微鏡下胎兒骨骼肌肌小節(jié)排列紊亂，出現(xiàn)纖維水腫和線粒體水腫等癥狀。在細(xì)胞水平上發(fā)現(xiàn)，與野生型細(xì)胞組和空細(xì)胞組相比在 RNA水平上，基因表達(dá)未發(fā)生明顯改變，但在蛋白水平上目的蛋白表達(dá)明顯提高。
　　家系2：該家系有5名患者，臨床表現(xiàn)為外耳廓異常，身材和四肢

7、修長(zhǎng)，雙手手指纖細(xì)關(guān)節(jié)攣縮，不能自主伸展等癥狀。全外顯子組測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)在FBN2基因存在 c.3344A>T（p.D1115V）一個(gè)新發(fā)突變，對(duì)其家庭 Sanger測(cè)序驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)該家系健康成員未攜帶該突變，有相似癥狀的患者都攜帶該突變。通過(guò)生物信息學(xué)分析該突變有著強(qiáng)致病性，其在該位點(diǎn)周圍存在多個(gè)突變位點(diǎn)，且該基因引起的癥狀和患者的癥狀相似，綜上所述該位點(diǎn)為該家系的致病位點(diǎn)。對(duì)先證者羊水驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)胎兒也攜帶該致病突變，對(duì)胎兒引產(chǎn)，結(jié)果胎兒臨床

8、表型和先證者表現(xiàn)相似，身材修長(zhǎng)，遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)攣縮，手指屈曲，耳朵褶皺異常等癥狀。經(jīng)過(guò)先癥者及其家屬知情同意后，我們留取胎兒骨骼肌對(duì)其進(jìn)行病理學(xué)觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胎兒骨骼肌線粒體水腫，纖維間也發(fā)生水腫，纖維間疏松。
　　家系3：該家系有2名患者，臨床癥狀表現(xiàn)：雙手十指攣縮，身材矮小，脊柱測(cè)凸，多關(guān)節(jié)翼狀贅皮等癥狀。經(jīng)全外顯子組測(cè)序技術(shù)在該家系內(nèi)發(fā)現(xiàn)一個(gè)CHRNG基因c.715C>T純合突變，該突變?yōu)橐阎虏⊥蛔?。通過(guò)Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果