RGD-重組蛛絲蛋白復(fù)合支架材料的研制.pdf

1、蜘蛛絲蛋白作為高性能的生物材料如人造肌腱、人工韌帶、人工器官、組織修復(fù)等組織工程新材料，具有十分誘人的應(yīng)用前景。國(guó)外對(duì)蜘蛛絲蛋白作為組織工程材料的研究報(bào)道較少，國(guó)內(nèi)以蜘蛛絲蛋白為材料制備組織工程材料除本課題組外也未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。 應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)和高分子物理化學(xué)手段，將具有特定細(xì)胞粘附信號(hào)識(shí)別功能的RGD三肽的基因重組蛛絲蛋白pNSR16(分子量約為60kD)分別與生物相容性的高分子材料聚乙烯醇(PVA)、聚己內(nèi)酯(PCL)復(fù)合，

2、充分發(fā)揮蛋白質(zhì)和高分子材料兩方面的優(yōu)異性能，可以得到一類綜合性能優(yōu)良的組織工程新材料。為此，本研究采用冷凍干燥/粒子瀝濾法和靜電紡絲法制備了兩類4種重組蛛絲蛋白復(fù)合支架材料(pNSR16/PVA和pNSR16/PCL的多孔支架材料和納米纖維支架材料)，對(duì)重組蛛絲蛋白復(fù)合支架材料結(jié)構(gòu)、理化性能進(jìn)行分析，并對(duì)其生物學(xué)性能進(jìn)行研究。 紅外光譜研究表明：甲酸使pNSR16分子構(gòu)象進(jìn)一步向無(wú)規(guī)卷曲方向轉(zhuǎn)變，飽和LiBr溶液則使其構(gòu)象向β-

3、鏈方向轉(zhuǎn)變；加熱和變性都能促使pNSR16分子構(gòu)象向β-鏈方向轉(zhuǎn)變；PVA和殼聚糖的加入，能明顯促進(jìn)pNSR16分子構(gòu)象由無(wú)規(guī)卷曲向β-鏈轉(zhuǎn)化。pNSR16/PCL支架材料的紅外光譜顯示：pNSR16和PCL可能只是以物理形式相結(jié)合。 力學(xué)性能測(cè)定表明：PVA可以改善pNSR16支架材料的力學(xué)性能：靜電紡絲可以提高復(fù)合支架材料的力學(xué)性能。 冷凍干燥/粒子瀝濾法制備pNSR16/PVA多孔支架材料的最佳制作配比和工藝是：采

4、用粒徑150-250μm的NaCl為致孔劑，pNSR16:PVA=100:4(w/w)，NaCl與pNSR16/PVA溶液按1:1(w/v)比例混合后倒膜，經(jīng)-80℃冷凍干燥時(shí)間2小時(shí)10分鐘后，再用65-75％乙醇變性后洗滌除鹽。得到的pNSR16/PVA多孔支架材料孔隙均勻，孔徑在100-200μm之間，符合細(xì)胞生長(zhǎng)的要求；且支架材料整體均勻，PVA與pNSR16相容性較好，未發(fā)生相分離現(xiàn)象。 靜電紡絲法制備粗細(xì)均勻的pNS

5、R16/PVA復(fù)合納米纖維的電紡過(guò)程參數(shù)是：電紡溫度45℃，紡絲液濃度15％、電紡電壓80kV、固化距離20cm、擠出速度5ml/h。掃描電鏡(SEM)結(jié)果表明：pNSR16/PVA復(fù)合納米纖維的直徑隨著紡絲液濃度、紡絲電壓、固化距離以及擠出速度的增大均呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)；乙醇處理會(huì)引起復(fù)合納米纖維間產(chǎn)生明顯的粘連現(xiàn)象。 在pNSR16/PCL濃度為30％，NaCl的粒徑為150-250μm，NaCl相對(duì)于pNSR16/PCL溶液體

6、積的重量為1:1時(shí)，可以制得孔徑達(dá)100μm以上的pNSR16/PCL多孔支架，pNSR16/PCL多孔支架的孔徑已基本滿足常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)的要求，但pNSR16/PCL多孔支架的孔結(jié)構(gòu)分布不是很均勻，孔的結(jié)構(gòu)也不是完全相通的。 電紡過(guò)程參數(shù)控制在紡絲液濃度30％、電紡電壓80kV、固化距離20cm、擠出速度5ml/h的條件下，可以獲得粗細(xì)均勻的pNSR16/PCL復(fù)合納米纖維。當(dāng)pNSR16與PCL的質(zhì)量比為5:100、紡絲液濃度

7、為30％時(shí)，pNSR16/PCL復(fù)合納米纖維直徑隨著紡絲電壓的增大呈現(xiàn)減小的趨勢(shì)，當(dāng)電紡電壓達(dá)90kV時(shí)，纖維直徑分布不均勻，纖維間有部分粘連；復(fù)合納米纖維直徑隨著固化距離增大也呈現(xiàn)減小的趨勢(shì)，復(fù)合納米纖維直徑隨著擠出速度增大呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)，同時(shí)纖維變得不均勻。 pNSR16/PVA多孔支架在PBS磷酸鹽緩沖液和含有彈性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶的PBS磷酸鹽緩沖液中的降解行為初步證實(shí)了pNSR16/PVA多孔支架具有生物

8、可降解性，說(shuō)明可以通過(guò)改變pNSR16與PVA的混合比例來(lái)調(diào)節(jié)支架的降解速度。pNSR16/PVA支架材料浸提液的細(xì)胞毒性反應(yīng)為1級(jí)、符合生物材料的合格標(biāo)準(zhǔn)；鼠成纖維細(xì)胞NIH-3T3和人類結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2與pNSR16/PVA多孔支架材料的體外聯(lián)合培養(yǎng)結(jié)果表明：pNSR16/PVA多孔支架具有良好的細(xì)胞相容性，有利于細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)。 pNSR16/PVA復(fù)合納米纖維的孔隙率、吸濕性、滲出液在纖維間和纖維內(nèi)的分布比值

9、、溶漲率分別為84.85％、4.381 g/g、6.140 g/g，pNSR16/PCL復(fù)合納米纖維的相應(yīng)指標(biāo)為86.47％、4.794 g/g、14.58 g/g，均比多孔支架有明顯的增加，表明靜電紡絲技術(shù)可以有效提高pNSR16/PVA支架作為生物敷料的相關(guān)性能指標(biāo)。 pNSR16/PCL復(fù)合支架材料的毒性等級(jí)在1級(jí)以下、符合生物材料的合格標(biāo)準(zhǔn)；pNSR16/PCL復(fù)合支架材料的毒性小于純PCL支架材料，說(shuō)明pNSR16能