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1、蛛絲蛋白纖維作為一種優(yōu)異的生物學(xué)材料,在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域具有極大的潛在應(yīng)用價(jià)值,已有研究表明,重組蛛絲蛋白可用作血管、神經(jīng)導(dǎo)管及藥物載體等。目前重組蛛絲蛋白的研究主要集中于牽引絲、次壺腹腺絲及鞭毛狀腺絲蛋白質(zhì)。缺少梨狀腺絲蛋白( Pyriform Spidroin, PySp)的研究,尤其是大腹園蛛(A. ventricosus)梨狀腺絲蛋白的編碼序列至今仍未有報(bào)道,其生物學(xué)功能仍有待研究。為了解析大腹園蛛梨狀腺絲蛋白重復(fù)區(qū)(Rp)的功
2、能、研究C端非重復(fù)區(qū)(CT)對(duì)成絲機(jī)理的影響、測(cè)試?yán)鏍钕俳z素蛋白的力學(xué)性能、獲得一種材料學(xué)性能優(yōu)良的重組蛛絲蛋白、為蛛絲蛋白的仿生提供理論依據(jù),本課題開展了以下幾個(gè)方面的研究工作并都取得了較理想的研究結(jié)果。
?。?)以本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的大腹園蛛基因組為模板,設(shè)計(jì)特異性引物,克隆獲得一段蛛絲蛋白編碼序列,通過Blast比對(duì)分析,確定該序列包含大腹園蛛梨狀腺絲(Piriform spidroin,PySp)的一段完整重復(fù)區(qū)(Rp)的
3、編碼序列,該序列為A. ventricosus的首條完整的PySp重復(fù)區(qū)基因序列,填補(bǔ)了國內(nèi)A. ventricosus絲蛋白編碼基因克隆的空白,為絲蛋白基因的研究增填了新成員。
?。?)將PySp-Rp模塊與MiSp-NT/CT模塊重組構(gòu)建不具有CT功能模塊的MiSpNT-PySpRp與具有完整功能模塊的MiSpNT-PySpRp-MiSpCT重組蛛絲蛋白表達(dá)載體,進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)和純化,并且優(yōu)化兩種蛋白的表達(dá)產(chǎn)量。經(jīng)過SDS-
4、PAGE膠和Western-blot鑒定,兩種重組蛛絲蛋白均能在大腸桿菌中表達(dá),表達(dá)產(chǎn)量較高,形成包涵體,經(jīng)過變性純化,獲得了純度較高的重組蛛絲蛋白。
?。?)采用圓二色譜(Circular dichroism, CD)測(cè)定不同pH下兩種重組蛛絲蛋白溶液的二級(jí)結(jié)構(gòu),計(jì)算各二級(jí)結(jié)構(gòu)百分含量的變化;使用傅里葉紅外光譜(ATR-FTIR)測(cè)定兩種重組蛛絲蛋白凍干后的紅外光譜,計(jì)算其酰胺Ⅰ帶的各二級(jí)結(jié)構(gòu)百分含量。比較兩種蛛絲蛋白的二級(jí)結(jié)
5、構(gòu)組成發(fā)現(xiàn),隨著pH值降低,CT結(jié)構(gòu)域會(huì)引發(fā)PySp二聚化促進(jìn)其成絲;紅外光譜顯示,CT結(jié)構(gòu)域會(huì)增加PySp纖維的β折疊的百分含量,揭示了C端非重復(fù)區(qū)的存在可促進(jìn)絲素蛋白質(zhì)的組裝成絲,有利于提高固著絲纖維機(jī)械性能。
?。?)使用掃描電鏡(Scanning electron microscope,SEM)觀察濕紡獲得的 MiSpNT-PySpRp-MiSpCT重組蛛絲蛋白纖維的表面形態(tài),顯示濕紡形成的 MiSpNT-PySpRp-
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