基于RGD-蛛絲蛋白復(fù)合納米纖維構(gòu)建小直徑血管支架的研究.pdf

1、組織工程血管為解決小直徑血管移植物來源提供了有效的途徑，是近年來血管損傷修復(fù)研究的熱點。支架材料在組織工程血管中起關(guān)鍵作用，不僅具有直接支撐細(xì)胞的特性，而且影響細(xì)胞的生長、遷移、分化以及決定新生組織的結(jié)構(gòu)。復(fù)合材料是近年組織工程血管支架材料研究的重點和趨勢。
　　 蜘蛛絲纖維的化學(xué)本質(zhì)為蛋白質(zhì)，因其顯著的力學(xué)性能、生物可降解性及良好的生物相容性，成為醫(yī)學(xué)組織工程感興趣的一類特殊的生物材料。根據(jù)蜘蛛絲的結(jié)構(gòu)和功能特性，本文在實驗室

2、前期通過基因工程技術(shù)方法制備蛛絲蛋白，并在蛛絲蛋白的功能重復(fù)基因序列中引入RGD（精氨酸.甘氨酸.天冬氨酸）三肽密碼子，構(gòu)建并表達了RGD-蛛絲蛋白（命名為pNSR32，分子量約102KD），生物活性分子RGD三肽是黏附蛋白中能夠為細(xì)胞表面特異受體蛋白識別的最小短肽序列，是目前應(yīng)用最廣、最有效的促黏附肽。聚己內(nèi)酯（PCL）是一種新型脂肪族聚酯，以其良好的機械性能、無毒性、可塑性等優(yōu)良性能廣泛應(yīng)用于生物材料領(lǐng)域。殼聚糖（CS）則有優(yōu)良的生

3、物相容性和可降解性。本文將pNSR32、PCL和CS三種材料共混，采用靜電紡絲技術(shù)制備pNSR32/PCL/CS復(fù)合納米纖維小直徑組織工程血管支架，并對支架的理化性能以及生物相容性進行評價，得到一種綜合性能優(yōu)良、滿足組織工程血管支架要求的新型的生物材料。
　　 本文實驗結(jié)果如下：
　　 靜電紡絲制備pNSR32/PCL/CS復(fù)合納米纖維小直徑組織工程血管支架材料各組分的最佳配比和工藝參數(shù)分別是：pNSR32、PCL和CS

4、的質(zhì)量比為10/80/10，電紡過程工藝參數(shù)：紡絲液濃度30％、電壓80kV、固化距離20cm、擠出速度5 mL/h、轉(zhuǎn)軸內(nèi)徑為4mm條件下獲得內(nèi)徑為4mm、長度為8cm、纖維直徑粗細(xì)均勻的pNSR32/PCL/CS復(fù)合納米纖維小直徑血管支架。
　　 傅立葉紅外光譜分析表明pNSR32與PCL和CS以物理方式共混，三者物質(zhì)之間并未形成新化學(xué)鍵；pNSR32/PCL/CS復(fù)合納米纖維小直徑血管支架的孔隙率和親水性分別達到89.6％

5、和85.3％，有利于增加細(xì)胞的親和性；分別選擇磷酸鹽溶液和含豬胰脂肪酶的磷酸鹽溶液，通過殘余重量百分考察pNSR32/PCL/CS血管支架的體外降解行為，結(jié)果表明pNSR32/PCL/CS支架材料有一定的降解速度，但降解較慢，酶解速度快于水解速度，這是由于支架酶解的同時還有進行水解；力學(xué)性能測試結(jié)果表明，pNSR32/PCL/CS支架的縫合強度符合手術(shù)縫合的要求，支架的抗張強度、楊氏模量和斷裂伸長率均優(yōu)于天然豬冠狀動脈。
　　

6、通過溶血實驗、動態(tài)凝血時間實驗、血小板黏附實驗以及復(fù)鈣化凝血時間對pNSR32/PCL/CS血管支架材料進行血液相容性的評價，實驗結(jié)果表明支架的溶血率為1.5％，小于5％，符合生物材料的溶血要求：pNSR32/PCL/CS的動態(tài)凝血時間實驗中支架在前30minBCI下降的較快，之后則緩慢下降；與PCL和PCL/CS相比，pNSR32/PCL/CS復(fù)合支架表面黏附的血小板要少；pNSR32/PCL/CS的復(fù)鈣化時間明顯長于PCL，綜上實驗

7、結(jié)果說明pNSR32/PCL/CS小直徑血管支架具有良好的血液相容性。
　　 采用MTT的方法考察pNSR32/PCL/CS支架材料的細(xì)胞毒性，并通過NIH-3T3細(xì)胞與支架復(fù)合培養(yǎng)考察其對細(xì)胞黏附、生長和分化的影響，評價pNSR32/PCL/CS復(fù)合支架的細(xì)胞相容性。MTT實驗結(jié)果表明，與單純PCL浸提液相比，pNSR32/PCL/CS和pNSR32/PCL復(fù)合材料浸提液能較明顯促進NIH-3T3細(xì)胞的生長和增殖，根據(jù)細(xì)胞毒性

8、評定標(biāo)準(zhǔn)，分析pNSR32/PCL/CS復(fù)合支架材料毒性等級在1級以下，符合生物材料的要求。細(xì)胞支架增殖曲線測定結(jié)果表明，在PCL材料上增殖速度較慢，而在pNSR32/PCL/CS支架上剛開始增殖較快，以后則因為空間限制細(xì)胞增殖速率開始下降。SEM和HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，pNSR32/PCL/CS復(fù)合支架更利于NIH-3T3細(xì)胞黏附，細(xì)胞在材料表面增殖形成多層結(jié)構(gòu)，細(xì)胞在復(fù)合納米纖維支架表面生長呈現(xiàn)一定的方向性，但是基本停留在支架表面生長，

9、并未見細(xì)胞向支架內(nèi)部遷移。免疫組化實驗結(jié)果說明NIH-3T3細(xì)胞在各組支架上均可正常表達bFGF因子，但在pNSR32/PCL/CS和pYSR32/PCL含RGD蛛絲蛋白支架材料上呈現(xiàn)更多的bFGF成纖維生長因子，說明RGD-蛛絲蛋白明顯改善了血管支架的細(xì)胞相容性，有利于種子細(xì)胞的黏附、生長和特殊因子的表達。
　　 以大鼠為實驗對象，將pNSR32/PCL/CS血管支架或其浸提液移入動物體內(nèi)，觀察機體的炎癥反應(yīng)和毒性反應(yīng)。pNS

10、R32/PCL/CS復(fù)合支架材料以及醫(yī)用膠原在術(shù)后28d材料局部炎性反應(yīng)消退，炎癥細(xì)胞基本消失，肌纖維結(jié)構(gòu)排列有序，纖維囊壁趨向變薄，有大量新生血管出現(xiàn)，根據(jù)評定標(biāo)準(zhǔn)均呈Ⅰ級-Ⅱ級反應(yīng)，評價為合格。組織相容性優(yōu)劣順序為醫(yī)用膠原>pNSR32/PCL/CS復(fù)合支架材料>PCL支架材料。結(jié)果表明pNSR32/PCL/CS復(fù)合支架材料具有良好的組織相容性，與組織無排斥作用，能減輕炎癥反應(yīng)。將pNSR32/PCL/CS支架浸提液注射到小鼠體內(nèi)進