RGD-蛛絲蛋白-聚已內(nèi)酯-明膠復(fù)合納米纖維小直徑血管支架的研究.pdf

1、自體血管和人工合成血管是臨床上主要的血管移植物,但自體血管因受來源限制,很難滿足臨床需求。人工合成血管材料如滌綸(Dacron)和膨脹聚四氟乙烯(ePTFE),在大直徑血管(內(nèi)徑>6mm)移植中取得了較好的效果,但應(yīng)用在小直徑血管(內(nèi)徑<6mm)的移植中易導(dǎo)致內(nèi)膜增生、血栓形成和阻塞等現(xiàn)象。血管組織工程技術(shù)為小直徑血管移植物提供了新思路,制備理想的血管支架是血管組織工程重要的研究內(nèi)容。
　　 本研究在課題組前期將RGD-蛛絲蛋白

2、(含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列,命名為pNSR32,分子量約為102KD)與聚己內(nèi)酯(Polycaprolacton,PCL)共混,應(yīng)用靜電紡絲技術(shù)制備納米纖維膜的基礎(chǔ)上,添加親水性良好的明膠(Gelatin,Gt),設(shè)計(jì)五組pNSR32/PCL/Gt三元共混材料體系,電紡結(jié)合旋轉(zhuǎn)接收裝置,制備pNSR32/PCL/Gt復(fù)合納米纖維小直徑血管支架,對所制備支架的理化性能進(jìn)行表征并研究支架的生物相容性。
　　 研究結(jié)果如下:

3、
　　 一、以Ⅰ型膠原酶消化與組織貼壁法相結(jié)合,建立了簡單高效的Sprague-Dawley(SD)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(SDRAECs)分離方法,倒置顯微鏡及伊紅染色觀察,分離的細(xì)胞呈多角形,鋪路石狀排列,為典型的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)。對內(nèi)皮細(xì)胞特異性因子-Ⅷ因子免疫組織化學(xué)及免疫熒光染色,證實(shí)獲得的細(xì)胞均為內(nèi)皮細(xì)胞。
　　 二、在前期pNSR32與PCL共混電紡的基礎(chǔ)上加入Gt,改善支架的親水性。以98％的甲酸為共同溶劑,設(shè)計(jì)

4、五組配比(質(zhì)量比)的共混體系:A組.pNSR32/PCL/Gt(0:100:0)、B組.pNSR32/PCL/Gt(5:95:0)、C組.pNSR32/PCL/Gt(5:85:10)、D組.pNSR32/PCL/Gt(5:75:20)、E組.pNSR32/PCL/Gt(5:65:30)。電紡參數(shù):紡絲液濃度30％,電壓80kV,固化距離20cm,擠出速度80μL/min,轉(zhuǎn)軸外徑3mm,轉(zhuǎn)軸轉(zhuǎn)速2rpm,制備了長3cm、厚0.3mm、內(nèi)

5、徑3mm的復(fù)合納米纖維小直徑血管支架。
　　 三、對A-E五組配比制備的小直徑血管支架的理化性能進(jìn)行表征。測試了支架的纖維直徑、孔徑、孔隙率、吸水率以及接觸角,發(fā)現(xiàn)隨著Gt量的增加,支架纖維直徑、孔徑、孔隙率、吸水率均逐漸增大,接觸角顯著減小。傅立葉紅外光譜(Fouriertransform infrared spectroscopy,FTIR)觀察到pNSR32、PCL、Gt三者間無新化學(xué)鍵形成,乙醇處理未改變支架的構(gòu)象；X-

6、射線衍射(X-ray diffraction,XRD)結(jié)果證實(shí)pNSR32與Gt的加入可增加支架結(jié)晶度。pNSR32/PCL/Gt復(fù)合支架在PBS中的降解速率慢于多酶降解液,pNSR32與Gt的加入促進(jìn)支架的降解速率,并與Gt的加入量成正相關(guān)。對C組配比支架的力學(xué)性能進(jìn)行檢測,結(jié)果為pNSR32/PCL/Gt(5:85:10)支架在干燥狀態(tài)下極限抗張強(qiáng)度2.67±0.22MPa,生理鹽水浸泡24h后,極限抗張強(qiáng)度降為1.59±0.16M

7、pa,斷裂伸長率從117％±15％上升至177％±13％,其縫合強(qiáng)度為3.6±1.2N,符合手術(shù)要求。
　　 四、探討A-E五組配比制備的小直徑血管支架的細(xì)胞相容性。MTT比色法比較各組支架的細(xì)胞毒性,五組配比支架浸提液對SDRAECs均無毒性,毒級在1級以內(nèi),符合生物材料要求。SDRAECs與支架復(fù)合培養(yǎng)分析支架對細(xì)胞生長、增殖、周期及表型的影響,觀察到Gt的加入改善了支架材料的細(xì)胞相容性,適宜的Gt含量(10％,C組)能提高

8、支架的細(xì)胞相容性。具體結(jié)果:SDRAECs在C組配比支架細(xì)胞的增殖速率最快；SEM觀察,DAPI染色及冰凍切片HE染色證實(shí)C組配比支架與A組,B組支架相比,能更好地支持SDRAECs粘附、生長、增殖；流式細(xì)胞技術(shù)檢測C組配比支架可促進(jìn)DNA復(fù)制,加速細(xì)胞增殖;免疫組化結(jié)果說明SDRAECs在C組配比支架上能正常表達(dá)Ⅷ因子；免疫熒光檢測表明C組配比支架支架較組織培養(yǎng)板(Tissue culture plate,TCP)更有利于SDRAEC

9、s增殖及功能的維持。
　　 五、探討A-E五組配比制備的小直徑血管支架的血液相容性。溶血試驗(yàn)結(jié)果表明A-E五組配比支架的溶血率分別為0.26％、0.13％、0.26％、0.55％、0.91％,均符合生物材料的溶血要求(<5％)。復(fù)鈣化凝血時(shí)間實(shí)驗(yàn)觀察到C組配比支架的復(fù)鈣化時(shí)間與B組相似,但均比A組支架的時(shí)間長,說明C組、B組支架抗凝性能優(yōu)于A組支架。動(dòng)態(tài)凝血時(shí)間測定結(jié)果提示C組配比支架抗凝血能力較強(qiáng)。血小板黏附試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在C組配比

10、支架上的血小板粘附數(shù)均較B組與A組支架少。綜上結(jié)果,C組配比即pNSR32/PCL/Gt(5:85:10)支架具有優(yōu)良的血液相容性。
　　 六、評價(jià)pNSR32/PCL/Gt(5:85:10)復(fù)合納米纖維小直徑血管支架的遺傳毒性。小鼠骨髓微核試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)pNSR32/PCL/Gt(5:85:10)支架浸提液的微核發(fā)生率為2.3‰±0.9‰,與生理鹽水組(2.8‰±1.3‰)類似,顯著低于環(huán)磷酰胺組(23.3‰±4.2‰)。單細(xì)胞

11、凝膠電泳試驗(yàn)結(jié)果表明pNSR32/PCL/Gt(5:85:10)支架浸提液沒有造成SDRAECs的DNA損傷。
　　 七、探討pNSR32/PCL/Gt(5:85:10)復(fù)合納米纖維小直徑血管支架的體內(nèi)生物相容性。全身急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明pNSR32/PCL/Gt(5:85:10)支架浸提液注射昆明小鼠體內(nèi)后96h,小鼠未表現(xiàn)中毒癥狀,體重增加量與生理鹽水對照組無顯著差異(p>0.5)。pNSR32/PCL/Gt(5:85:10

12、)支架植入SD大鼠肌肉,30d后炎癥反應(yīng)與醫(yī)用膠原對照組及空白對照組類似,炎癥細(xì)胞基本消失,纖維囊壁趨向變薄,肌纖維結(jié)構(gòu)排列有序,出現(xiàn)大量新生血管。對炎癥程度評定均為1級,符合標(biāo)準(zhǔn)要求。
　　 結(jié)論:Gt的加入改善了支架材料的性能,適宜的Gt含量(10％)能提高支架的生物相容性。pNSR32/PCL/Gt(5:85:10)復(fù)合納米纖維小直徑血管支架,理化性能良好,生物相容性優(yōu)異,作為小直徑血管組織工程支架材料應(yīng)用于臨床具有一定的