尿源性干細胞復(fù)合聚己內(nèi)酯-明膠電紡納米支架修復(fù)皮膚組織損傷的實驗研究.pdf

1、目的:1.研究從人類尿液分離的尿源性干細胞(UDSCs)的生物學(xué)特性,為再生醫(yī)學(xué)研究提供新型且豐富的種子細胞來源;2.構(gòu)建UDSCs復(fù)合聚己內(nèi)酯/明膠(PCL/GT)電紡納米纖維膜的組織工程皮膚,評價其對家兔全層皮缺損傷口的修復(fù)功能。
　　方法:1. UDSCs生物學(xué)特性觀察
　　1.1 LMM101培養(yǎng)基貼壁篩選法從健康人體尿液中分離培養(yǎng)UDSCs;
　　1.2 UDSCs表面標(biāo)記物鑒定:流式細胞術(shù)檢測表面抗原CD2

2、9、CD73、CD90、CD146、CD34和 HLA-DR等的表達情況;
　　1.3 UDSCs多向分化能力鑒定:采用成骨、成脂和成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別對UDSCs進行誘導(dǎo)培養(yǎng),并分別用茜素紅、油紅O和甲苯胺藍進行染色鑒定;
　　2.PCL/GT電紡納米纖維膜的制備:將聚己內(nèi)酯(poly(?-caprolactone),PCL)和明膠(Gelatin,GT)混合電紡制得混合納米纖維膜。通過傅立葉紅外光譜、接觸角、楊氏模量、體

3、外降解速率對材料進行表征。
　　3. PCL/GT電紡納米纖維膜生物相容性觀察:將UDSCs細胞種植于PCL/GT納米纖維膜上,利用CCK-8法檢測UDSCs增殖能力;活/死細胞染色方法觀察UDSCs在PCL/GT支架材料表面的存活率。并對UDSCs復(fù)合PCL/GT支架進行掃描電鏡(SEM)觀察。
　　4.UDSCs復(fù)合PCL/GT支架的構(gòu)建及體內(nèi)移植:
　　4.1將4-6代UDSCs進行GFP+慢病毒感染標(biāo)記后,接種

4、于PCL/GT支架上進行體內(nèi)移植;
　　4.2全層皮膚缺損模型及移植實驗:在新西蘭大白兔背部手術(shù)操作面積為2cm×2cm的皮膚全層缺損創(chuàng)面,隨機分別以(GFP+)UDSCs-PCL/GT復(fù)合膜、PCL/GT覆蓋,覆蓋紗布組為對照組。于14day觀察創(chuàng)面愈合情況并計算創(chuàng)面的愈合率。取創(chuàng)面及創(chuàng)面周圍組織做冰凍切片, HE染色和Masson’s三色染色后觀察皮膚結(jié)構(gòu)變化。細胞免疫熒光觀察表皮組織,新生血管變化及(GFP+)UDSCs在體

5、內(nèi)的生存情況。
　　5. UDSCs復(fù)合PCL/GT支架修復(fù)皮膚損傷的作用機制:通過CCK-8法、實時無標(biāo)記動態(tài)細胞分析技術(shù)(RTCA,Real Time Cellular Analysis)、劃痕實驗和成管實驗觀察UDSCs條件培養(yǎng)基對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)的增殖、遷移及成管能力的影響,以進一步分析UDSCs修復(fù)皮膚損傷的機制。
　　結(jié)果:1.從人類的新鮮尿液中成功分離培養(yǎng)出UDSCs。UDSCs細胞接種后3-8

6、天開始貼壁生長,8-12天后細胞呈集落生長,經(jīng)過2-3周傳代培養(yǎng)后細胞形態(tài)呈均一的成纖維細胞樣。流式細胞術(shù)檢測P3代UDSCs,結(jié)果顯示表達CD29、CD73、CD90和CD146,不表達CD34,HLA-DR。表明UDSCs符合間充質(zhì)干細胞的特征。體外采用成骨、成脂和成軟骨培養(yǎng)基分別對UDSCs進行誘導(dǎo)培養(yǎng),在21天,成骨誘導(dǎo)茜素紅染色呈陽性。在14天,成脂誘導(dǎo)油紅“O”染色呈陽性。在28天,成軟骨誘導(dǎo)細胞呈球狀團塊生長,冰凍切片后,

7、甲苯胺藍染色呈陽性。結(jié)果表明UDSCs在體外具有成骨、成脂和成軟骨的分化潛能。
　　2.成功制備了PCL/GT混合納米纖維膜:通過紅外分析明膠的氮氫鍵(N-H)變形振動吸收峰在1500-1550 cm-1和1600-1650 cm-1處被觀察到, PCL或明膠中的碳氧雙鍵(C=O)的特征吸收峰在1700-1760 cm-1處被觀察到,表明已經(jīng)成功制備了PCL/GT混合納米纖維膜,接觸角檢測結(jié)果表明,在25℃室溫下,PCL纖維支架對

8、水接觸角為109°±0.4°,通過混紡后,PCL/GT纖維支架接觸角減小到接近0°,表明電紡入GT纖維可以增強PCL薄膜的親水性,有利于提高PCL纖維膜材料的生物相容性。楊氏模量的結(jié)果顯示PCL/GT纖維的力學(xué)性能和人皮膚組織很接近。在模擬體液中PCL/GT在6周后失重率達到了90％以上,而PCL膜6周后失重率不到5%,表明有明膠纖維降解的微環(huán)境能促進復(fù)合膜中PCL纖維的降解。
　　3.SEM和活/死細胞染色結(jié)果顯示,培養(yǎng)7天后,

9、UDSCs在PCL/GT膜上黏附,呈現(xiàn)各種形態(tài)并向材料內(nèi)部遷移生長,細胞生存狀態(tài)良好。CCK-8法結(jié)果表明UDSCs在PCL/GT支架上增殖效率較好。表明PCL/GT支架具有良好的生物相容性。
　　4. UDSCs-PCL/GT具有顯著促進皮膚損傷修復(fù)的作用。在14天,兔創(chuàng)面收縮率,UDSCs-PCL/GT組>PCL/GT組(p<0.05)>對照組(p<0.05);HE染色和Masson染色結(jié)果表明UDSCs-PCL/GT組相比較

10、于PCL/GT組和對照組,皮膚結(jié)構(gòu)完整,創(chuàng)面上皮化程度高,新生膠原纖維面積大(p<0.01)且排列整齊,可見基本發(fā)育完整的皮膚附件即新生致密毛囊。從細胞免疫熒光的染色結(jié)果觀察到, UDSCs-PCL/GT組的表皮面積比PCL/GT組大(p<0.01),與對照組相比存在顯著的差異(p<0.01)。在7天和14天,UDSCs-PCL/GT組的新生血管密度相比于PCL/GT組和對照組均存在顯著的差異(p<0.01)。熒光顯微鏡下觀察到傷口組織

11、在7天廣泛表達(GFP+)UDSCs,在14天未見表達。提示UDSCs有可能是通過干細胞的旁分泌機制促進了血管新生從而促進損傷的修復(fù)。
　　5. UDSCs條件培養(yǎng)基可促進HUVECs增殖、遷移,并提高HUVECs的成管能力。CCK-8檢測結(jié)果表明UDSCs條件培養(yǎng)基能明顯提高HUVECs增殖效率;RTCA和劃痕實驗表明UDSCs條件培養(yǎng)基能影響HUVECs,促進其遷移;成管實驗結(jié)果觀察到UDSCs條件培養(yǎng)基提高了毛細血管管腔形成

12、數(shù)量。表明UDSCs旁分泌因子與HUVECs的血管生成能力有關(guān)。
　　結(jié)論:1.本研究建立了對UDSCs的分離培養(yǎng)技術(shù),其生物學(xué)特性符合間充質(zhì)干細胞的特征,其具有來源豐富、取材無創(chuàng)及可來源于自體等優(yōu)勢,有望成為再生醫(yī)學(xué)新的種子細胞來源;2.本研究制備的PCL/GT納米纖維支架具有良好的力學(xué)性能和生物相容性,符合皮膚組織工程支架材料的要求;3.UDSCs復(fù)合PCL/GT納米纖維膜具有顯著促進皮膚傷口愈合的作用,其作用機制可能是通過干