人脫細胞羊膜復合脂肪源性干細胞修復大鼠全層皮膚損傷的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 皮膚具有重要的物理、化學及生物學屏障功能，皮膚創(chuàng)傷所引起的局部或全身損害均與皮膚屏障的喪失有關，盡早修復缺損皮膚并最大可能恢復功能與外觀已成為治療重要目標。傳統(tǒng)修復方法有：自體植皮、同種異體植皮、異種植皮和人工合成皮膚產(chǎn)品的應用。但由于供區(qū)不足、免疫排斥及傳播疾病等缺點，使其應用受到限制，尋找一種理想的皮膚替代物一直是臨床上一個亟待解決的難題。
　　 真皮在皮膚損傷的修復過程中具有重要作用，選擇合適的種子細

2、胞和支架材料來構建真皮替代物尤為重要。羊膜的研究由來已久，應用羊膜來構建軟骨、角膜、周圍神經(jīng)橋接物、肌腱、血管及皮膚已見報道，而應用脫細胞羊膜作為支架材料構建真皮比羊膜更具有獨特的優(yōu)勢。脫掉細胞成分使其無免疫原性，所含的Ⅰ、Ⅳ型膠原蛋白、層粘連蛋白、纖維粘連蛋白及硫酸肝素蛋白多糖等成分有利于細胞的黏附、移行及上皮化，防止細胞凋亡；此外它來源廣泛、取材方便、易于處理和保存。
　　 干細胞包括胚胎干細胞和成體干細胞兩大類，其中胚胎干

3、細胞因涉及倫理學問題導致研究應用受到限制。較常用的成體干細胞目前主要包括脂肪源性干細胞（ADSCs）和骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs），但BMSCs的提取會給患者帶來劇烈疼痛，同時也存在一定的風險；采用吸脂術獲取ADSCs具有對供區(qū)損傷小、風險低、容易獲得、易于培養(yǎng)、減少患者緊張焦慮情緒等諸多優(yōu)點。此外，在體外不同誘導條件下，ADSCs可以被誘導為脂肪、骨、軟骨、肌及神經(jīng)等前體細胞，具有多向分化潛能，因此是理想的種子細胞。
　　

4、本實驗我們將研究人脫細胞羊膜（HAAM）與ADSCs的生物相容性，并探討HAAM負載ADSCs構建真皮替代物修復全層皮膚缺損的可能性。
　　 實驗材料和方法：
　　 取健康4月齡SD大鼠，體重250～300克，雌雄不限，麻醉、脫毛、消毒，于腹股溝處獲取脂肪后進行ADSCs的體外分離、培養(yǎng)和傳代；取第3代細胞常規(guī)HE染色，行CD44、CD49d、CD34免疫細胞化學染色鑒定。應用物理和酶消化法處理人羊膜獲得HAAM，HE染

5、色驗證細胞成分去除干凈，掃描電鏡觀察HAAM的結(jié)構特征。將鑒定后的ADSCs以2.0×105/cm2的密度種植于HAAM上皮面，體外共培養(yǎng)1～5天后分別進行掃描電鏡和MTT檢測。
　　 取SD大鼠30只，隨機分為A、B、C三組，建立背部全層皮膚損傷模型。A組創(chuàng)面植入復合ADSCs的HAAM，B組創(chuàng)面單純植入HAAM，C組創(chuàng)面紗布常規(guī)包扎，術后行大體觀察，于1、2、4周計算創(chuàng)口愈合率并取創(chuàng)面皮膚進行組織學觀察。
　　 所得

6、數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，采用單因素方差分析進行組間比較，P<0.05為有統(tǒng)計學意義，P<0.01為有顯著統(tǒng)計學意義。
　　 實驗結(jié)果：
　　 常規(guī)HE染色可見細胞呈長梭形，細胞核為橢圓形，位于細胞中央；免疫細胞化學染色表明第3代ADSCs表達CD44和CD49d，不表達CD34。人脫細胞羊膜行HE染色未見細胞殘留；掃描電鏡下觀察HAAM兩面具有不同的三維結(jié)構，上皮面的主要成分為網(wǎng)狀

7、纖維，較為致密，纖維相互交織呈網(wǎng)狀；基質(zhì)面的主要成分為膠原纖維，較稀疏，外觀長而卷曲，呈波浪狀，未見膠原纖維發(fā)生融合、斷裂、和降解。
　　 HAAM種植ADSCs共培養(yǎng)3天后電鏡下可見細胞生長狀態(tài)良好，胞體肥大呈長梭形隆起狀，胞膜外絨毛致密而略有彎曲，胞體下方形成豐富的偽足牢固黏附于HAAM上；MTT檢測顯示實驗組與對照組吸光度無顯著差異，HAAM對ADSCs體外增殖無抑制作用。
　　 動物模型移植術治療后，組間創(chuàng)面愈合