眼附屬器黏膜相關淋巴瘤Bcl10基因的檢測及其新的突變的意義的研究.pdf

1、本實驗研究通過檢測中國人群眼眶、結膜、淚腺、眼瞼部位的MALT淋巴瘤、不典型淋巴組織增生和淋巴組織反應性增生中Bcl10基因的存在，對照國外文獻報道，從中發(fā)現(xiàn)新的突變。觀察突變型Bel10基因蛋白表達及與激活NF-kappaB通路之間的關系，探討B(tài)cl10基因新的突變和突變型Bcl10基因在MALT淋巴瘤診斷方面的意義，為明確Bcl10基因激活NF-kappaB信號通路在MALT淋巴瘤發(fā)病機制中的作用提供新的依據(jù)。 一、目的：

2、 1．檢測Bcl10基因在眼眶、結膜、淚腺、眼瞼部位的MALT淋巴瘤、不典型淋巴組織增生、淋巴組織反應性增生中的表達，探討其在臨床診斷中的意義。 2．觀察突變型Bcl10基因和NF-kappaB在MALT淋巴瘤、不典型淋巴組織增生、淋巴組織反應性增生中的蛋白表達和核定位，考察兩者之間的相關性，發(fā)現(xiàn)突變型Bcl10蛋白的核表達對NF-kappaB信號通路的影響，推測Bcl10基因的突變所引起核表達導致NF-kappaB核轉(zhuǎn)位

3、在MALT淋巴瘤的發(fā)病機制中可能存在的作用。 二、方法： 1.收集上海第二軍醫(yī)大學長征醫(yī)院眼科2005年～2006年間收治的病理診斷為眼附屬器MALT淋巴瘤患者23例，不典型淋巴組織增生患者10例，淋巴組織反應性增生患者10例為陽性組，正常外周淋巴結組織12例為陰性對照組。陽性病例組以2001年WHO淋巴造血組織腫瘤分類為診斷標準，雙盲法經(jīng)兩位病理醫(yī)師篩選納入研究。其中23例MALT淋巴瘤患者，男性15例，女性8例，平均

4、發(fā)病年齡62.31±11.23歲(40歲～82歲)。10例不典型淋巴組織增生患者男性6例，女性4例，66.92±7.5歲(55歲～76歲)。10例淋巴組織反應性增生患者，男性5例，女性5例，71.69±3.65歲(55歲～78歲)。所有病例均采用手術切除新鮮標本。術后取標本立即凍存于液氮中保存?zhèn)溆谩?2.應用分子生物學方法檢測所有研究對象眼附屬器MALT淋巴瘤、不典型淋巴組織增生、淋巴組織反應性增生中Bcl10基因的表達，雙脫氧

5、Sanger法行DNA測序，進入GENBANK BLAST比對分析，對照國外報道序列，發(fā)現(xiàn)新的突變類型。 3.應用免疫組織化學(Envision法)和免疫熒光(間接法)檢測突變型Bcl10和NF-kappaB在所有研究對象中的蛋白表達。 4.應用激光共聚焦顯微鏡(Leica公司，TCS，SP2型)觀察Bel10和NF-kappaB表達的共定位。第1通道FITC(異硫氰酸熒光素)，最大吸收光譜488am，最大發(fā)射光譜520

6、nm，為二抗標記鼠抗人Bel10抗體，為綠色熒光；第2通道Cyanine3，最大吸收光譜543nm，最大發(fā)射光譜570nm，二抗標記NF-kappaBp65抗體，為紅色熒光。DAPI染核，紫外光發(fā)射光譜360nm。 5.數(shù)據(jù)用x±s表示。Bcl10基因的表達率、Bcl10基因的突變率在陽性組和陰性組之間的比較采用x<'2>檢驗，F(xiàn)isher確切概率法檢驗分析。Bcl10核表達和Bcl10突變率之間的關系、Bcl10核表達和NF-

7、kappaB表達之間的關系，采用x<'2>檢驗，F(xiàn)isher確切概率法檢驗和spearman等級相關分析。所有結果采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包進行分析，以P<0.05認為差異有顯著性意義。 三、結果： 1.陽性組43例研究對象中，21例(48.84％)檢出Bcl10基因的eDNA表達，比較國外報道突變序列，發(fā)現(xiàn)有新的突變12例(57.14％)。分別是外顯子294位核苷酸缺失129個堿基，導致編碼蛋白區(qū)由正常全長233位

8、氨基酸截短為99位氨基酸：該突變序列我們已發(fā)布于GENBANK(EF189176)。4例出現(xiàn)的同一種突變?yōu)椋和怙@子638位核苷酸點突變G→A，導致編碼蛋白區(qū)第213位氨基酸甘氨酸突變?yōu)楣劝彼?。外顯子308位核苷酸點突變T→C，導致編碼蛋白區(qū)第103位氨基酸頡氨酸突變?yōu)楸彼?；外顯子368位核苷酸點突變T→C，導致編碼蛋白區(qū)第123位氨基酸谷氨酸突變?yōu)楦拾彼幔和怙@子374位核苷酸點突變A→G，導致編碼蛋白區(qū)第125位氨基酸苯丙氨酸突變?yōu)榻z

9、氨酸：外顯子5位核苷酸點突變T→C，導致編碼蛋白區(qū)第2位氨基酸谷氨酸突變?yōu)楦拾彼?。外顯子412位核苷酸點突變T→C，導致編碼蛋白區(qū)第103位氨基酸頡氨酸突變?yōu)楸彼帷?例突變外顯子145位核苷酸點突變A→G國外已見報道。10例不典型淋巴組織增生中有4例檢出Bcl10基因的cDNA表達，有1例發(fā)現(xiàn)外顯子346位核苷酸缺失33個堿基，導致編碼蛋白區(qū)第116位氨基酸到126位氨基酸的改變，是為mRNA的不同剪輯體。此例國外已見報道。10例淋巴

10、組織反應性增生中2例檢出Bc110基因的cDNA表達，1例檢出新的突變?yōu)橥怙@子638位核苷酸點突變G→A，與MALT淋巴瘤中出現(xiàn)4例同樣的突變相同。12例正常外周淋巴結組織未檢出Bcl10基因的表達。Bcl10基因的突變率在陽性組和陰性組之間差異有顯著性(P<0.05)。Bcl10基因的突變率在不同的惡性程度組中差異有顯著性(P<0.05)。Bcl10基因突變在不同發(fā)病部位之間、不同臨床分期之間的差異不具有顯著性(P>0.05)。

11、 2．陽性組中23例MALT淋巴瘤中，Bcl10蛋白在20例MALT淋巴瘤石蠟標本中表達(86.96％)，其中胞核和胞漿同時表達13例(65.0％)；胞漿表達7例(35.0％)，陰性3例(13％)。10例不典型淋巴組織增生中，5例(50％)胞漿彌漫表達Bcl10。10例淋巴組織反應性增生中，1例(10％)胞核和胞漿同時表達Bcl10，3例(30％)胞漿表達Bcl10。陰性組12例正常淋巴結中不表達。Bcl10蛋白的核表達和Bcl10基

12、因突變之間差異有顯著性(P<0.05)，兩者之間具有相關性(P<0.05)。Bcl10蛋白的核表達在不同的惡性程度組之間差異無顯著性(P>0.05)。 陽性組23例MAIT淋巴瘤中，18例胞核和胞漿同時表達NF-kappaB(78.3％)，胞漿表達5例(21.7％)。10例不典型淋巴組織增生中，7例(70％)胞漿彌漫表達NF-kappaB。10例淋巴組織反應性增生中，1例(10％)胞核和胞漿同時表達NF-kappaB，5例(50

13、％)胞漿表達NF-kappaB。陰性組12例正常淋巴結中均在胞漿表達NF-kappaB。 NF-kappaB蛋白在眼附屬器MALT淋巴瘤、不典型淋巴組織增生、淋巴組織反應性增生中的陽性率表達差異有顯著性(P<0.05)。Bcl10蛋白的核表達和NF-kappaB表達的差異有顯著性(P<0.05)，兩者之間具有相關性(P<0.05)。 3．激光共聚焦顯微鏡斷層掃描的信息用SFP選項進行彩色三維重建后，可見用FITC標記的Bcl10

14、蛋白呈現(xiàn)點狀或簇狀綠色熒光顆粒分布于細胞核和胞質(zhì)。用Cy3標記的NF-kappaB蛋白呈現(xiàn)彌漫紅色熒光廣泛分布于胞質(zhì)。重建圖像后，可見黃色熒光為Bcl10和NF-kappaB共定位，其中Bcl10和NF-kappaB共表達有13例。Bcl10和NF-kappaB的共定位表達呈正相關(P<0.05)。 四、結論： 1．Bcl10基因在中國人群眼眶、結膜、淚腺、眼瞼部位的MALT淋巴瘤、不典型淋巴組織增生、淋巴組織反應性增生

15、中有新的突變形式，共發(fā)現(xiàn)了12例新的突變，國內(nèi)外未見報道。2例突變與國外報道相同。其中以第213位氨基酸甘氨酸突變?yōu)楣劝彼?GGA→GAA)為主要新的突變形式；其次為截斷型突變即由Bcl10的CARD結構域至C端截斷，是為全長233位氨基酸截斷為99位氨基酸。該突變序列我們已發(fā)布于GENBANK(EF189176)。 2．本研究在不典型淋巴組織增生和淋巴組織反應性增生中發(fā)現(xiàn)了新的突變證明Bel10基因突變的檢測靈敏于病理診斷，能

16、在尚沒有形態(tài)學改變及其他可鑒別指標下，判斷出病變階段和性質(zhì)的改變，能對患者提供準確和及時的早期診斷，避免誤診和漏診，為取得滿意的療效提供機會。 3．突變型Bel10基因與腫瘤的惡性程度有關，其蛋白見于核表達，并與NF-kappaB胞核共定位表達呈正相關，此結果與Bcl10核轉(zhuǎn)位激活NF-kappaB轉(zhuǎn)錄入核引起細胞凋亡改變的理論是一致的，可作為早期診斷MALT淋巴瘤的靈敏指標。通過對Bcl10基因突變的檢測，為明確Bel10激活