CSF V和PCV2感染后免疫抑制性受體轉(zhuǎn)錄水平研究及阻斷豬PD-1-PD-L1通路多肽基序鑒定.pdf

1、免疫抑制性受體傳遞免疫抑制和免疫耐受信號(hào)，是獲得性免疫調(diào)節(jié)的重要分子，包括程序性死亡因子1（programmed death-1，PD-1）、細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)和淋巴細(xì)胞活化基因-3（lymphocyte activation gene-3，LAG-3）等。多種慢性或持續(xù)性病毒感染過(guò)程中，PD-1、CTLA-4或LAG-3等過(guò)

2、量表達(dá)，活化免疫負(fù)調(diào)節(jié)信號(hào)通路，引起免疫細(xì)胞凋亡、增殖能力降低以及抗病毒細(xì)胞因子分泌減少等，造成機(jī)體免疫功能損傷或免疫抑制，阻斷PD-1、CTLA-4、LAG-3與其相應(yīng)配體相互作用，可以逆轉(zhuǎn)T細(xì)胞免疫功能。豬瘟（classical swine fever,CSF）和斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS)是豬的兩種重要傳染性疾病，目前對(duì)CSF和PMWS引

3、起免疫功能損傷或免疫抑制的致病機(jī)制已經(jīng)從病原和宿主兩方面進(jìn)行了深入廣泛的研究，但是，在宿主效應(yīng)細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)方面研究較少，免疫抑制性受體是否參與CSF和PMWS的免疫致病機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本課題旨在研究CSF和PMWS感染過(guò)程中免疫抑制性受體的轉(zhuǎn)錄水平及其對(duì)免疫效應(yīng)影響，篩選和鑒定能阻斷豬PD-1/PD-L1通路的多肽基序，以期進(jìn)一步揭示CSF和PMWS的免疫致病機(jī)制，為研究免疫調(diào)節(jié)藥物和佐劑提供理論基礎(chǔ)。
　　PD-1/PD-

4、Ls通路活化是多種病毒性疾病造成免疫損傷的重要致病機(jī)制。本部分主要研究CSFV感染豬后PD-1及其配體PD-L1和PD-L2的轉(zhuǎn)錄水平變化。45日齡CSFV抗體陰性仔豬感染CSFV石門株，分成兩組:感染組（10頭）和對(duì)照組（5頭），頸部肌肉注射105×TCTD50的CSFV/頭，對(duì)照組注射0.5 mL的PBS，感染后0d、3d、7d、10d、14d和21 d，頸靜脈采集抗凝血5 mL，分離豬外周血單核細(xì)胞(Peripheral Bloo

5、d Mononuclear Cells，PBMCs)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time,qPCR)檢測(cè)PBMCs中PD-1、PD-L1、PD-L2、IL-2、IL-10的轉(zhuǎn)錄水平，同時(shí)檢測(cè)血漿中CSFV載量，用CFSE標(biāo)記PBMCs，rswIL-2和CD3單抗刺激，測(cè)定T細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果顯示，在感染后第3 dPD-1和PD-L1轉(zhuǎn)錄水平開(kāi)始升高(p＜0.05)，第7d達(dá)到峰值(p＜0.01)，而PD-

6、L2轉(zhuǎn)錄水平在感染后3d達(dá)到峰值(p＜0.01)，之后開(kāi)始降低。血漿中CSFV載量在感染后第7d達(dá)到峰值，PD-1及其配體轉(zhuǎn)錄水平與CSFV載量成正相關(guān)。免疫負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-10轉(zhuǎn)錄水平在感染后7d顯著升高(p＜0.01)，IL-2轉(zhuǎn)錄水平在PD-1及其配體轉(zhuǎn)錄水平下降之后即感染后14d顯著升高(p＜0.05)，感染后第7d，T細(xì)胞增殖能力降低。結(jié)果表明CSFV感染能夠引起PD-1/PD-Ls通路改變。
　　選取河南新鄉(xiāng)地區(qū)某

7、規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)疑似患PMWS的斷奶仔豬9頭，臨床癥狀表現(xiàn)為漸進(jìn)性消瘦或生長(zhǎng)緩慢、厭食、精神沉郁、皮膚蒼白、被毛蓬亂、咳嗽和呼吸困難等，健康對(duì)照組6頭，PCR檢測(cè)血漿、肺臟和脾臟中病原PCV2、PRRSV、PPV、PRV和CSFV，采集豬抗凝血5mL/頭，采集抗凝血2次，間隔7d，分離PBMCs，qPCR檢測(cè)PBMCs中PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、LAG-3、PTEN以及細(xì)胞因子IL-2、IL-10和IFN-γ的轉(zhuǎn)錄水平

8、，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PBMCs的增殖能力。結(jié)果顯示，發(fā)病豬的血漿、肺臟和脾臟中分別擴(kuò)增出PCV2381 bp特異性目的條帶，未擴(kuò)增出PRV、PPV、PRRSV和CSFV的特異性目條帶，根據(jù)臨床癥狀和病原檢測(cè)，確診發(fā)病豬患PMWS。PD-L1(p＜0.01)和PD-L2(p＜0.05)轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，而PD-1、CTLA-4和LAG-3的mRNA水平無(wú)顯著變化，PTEN的mRNA水平顯著升高(p＜0.01)，PTEN表達(dá)量升高證實(shí)PD-1/

9、PD-Ls通路的活化，而且PD-L1還可以與B7分子結(jié)合抑制B7與CD28分子的結(jié)合，阻斷共刺激信號(hào)B7/CD28通路，抑制T細(xì)胞活化;IL-10轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(p＜0.01)，IL-2和IFN-γ輕微升高，但是統(tǒng)計(jì)學(xué)分析不顯著，PBMCs增殖能力顯著降低。結(jié)果表明自然感染PMWS過(guò)程中可以引起PD-/PD-Ls通路改變，抗病毒細(xì)胞免疫功能降低，進(jìn)一步揭示PMWS的免疫致病機(jī)制。
　　根據(jù)PD-1與其配體復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)與結(jié)合位

10、點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成包含PD-1與PD-L1結(jié)合位點(diǎn)的系列多肽，初步探討合成多肽阻斷PD-1/PD-L1通路的免疫調(diào)節(jié)。分離患PMWS豬的PBMCs，CFSE標(biāo)記細(xì)胞，多肽與ConA共同刺激培養(yǎng)3d，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PBMCs的增殖變化;選取能促進(jìn)PBMCs增殖的多肽標(biāo)記FITC，檢測(cè)標(biāo)記多肽與豬重組蛋白PD-L1及PBMCs的結(jié)合情況;選取能結(jié)合豬PD-L1蛋白的多肽與滅活CSFV共同免疫小鼠后，檢測(cè)血清中CSFV的抗體水平。結(jié)果顯示，多肽PD