桑樹miRNA的鑒定及其在蠶?；プ髦械墓δ苎芯?pdf

1、研究利用寡食性昆蟲-家蠶和桑葉這對組合，探究家蠶攝食桑葉后，桑樹的miRNA是否進(jìn)入了家蠶的體內(nèi)。利用Illumina高通量測序方法對野生桑（川桑）、栽培桑（湖桑32號和倫教109）葉片以及家蠶血淋巴小RNA進(jìn)行大規(guī)模測序，分析鑒定桑葉的miRNA，利用生物信息學(xué)方法分析家蠶血淋巴中是否存在桑樹源miRNA。采用莖環(huán)PCR、T-A克隆、Sanger測序驗(yàn)證該結(jié)果，并探究了桑樹源miRNA是否廣泛存在家蠶的組織中。利用微滴數(shù)字PCR技術(shù)檢

2、測人工合成的miR166b是否也能進(jìn)入家蠶的體內(nèi)。另外，采用轉(zhuǎn)錄組測序、RT-PCR以及表型調(diào)查等方法探究桑樹源miR166b對家蠶的生理活動(dòng)是否有影響。獲得的主要結(jié)果如下:
　　1.利用高通量測序技術(shù)鑒定川桑的保守miRNA和新miRNA
　　研究采用solexa技術(shù)對川桑3個(gè)組織（葉、皮和雄花）的小RNA文庫進(jìn)行高通量測序，利用生物信息學(xué)方法，在川桑的3個(gè)組織中共鑒定到85個(gè)保守miRNA，分屬于31個(gè)家族，262個(gè)新m

3、iRNA，分別位于川?；蚪M的371個(gè)位點(diǎn)上。采用miRNA靶基因預(yù)測的方法，20個(gè)保守miRNA家族和113個(gè)新miRNA分別預(yù)測得到89和332個(gè)候選靶基因。
　　川桑保守miRNA的進(jìn)化保守性分析表明川桑大部分miRNA同其它雙子葉和單子葉植物都較為保守。表達(dá)水平分析表明川桑保守miRNA家族的表達(dá)水平范圍較廣，具有組織傾向性，葉、皮和雄花組織傾向性表達(dá)的miRNA家族分別是5個(gè)、5個(gè)和8個(gè)。RT-PCR結(jié)果顯示部分保守mi

4、RNA在葉、皮和雄花的表達(dá)譜模式同高通量測序結(jié)果一致。
　　川桑新miRNA的特點(diǎn)分析表明，新miRNA前體長度范圍與其它已報(bào)道的植物相似;最小折疊自由能平均值低于tRNA和rRNA;鑒定到90個(gè)新miRNA對應(yīng)miRNA*序列，進(jìn)一步表明了新預(yù)測miRNA的準(zhǔn)確性。表達(dá)水平分析表明新miRNA的表達(dá)水平也較為寬廣，總體表達(dá)水平遠(yuǎn)低于保守miRNA，也具有組織傾向性，其中58個(gè)、84個(gè)和72個(gè)分別具有葉、皮和雄花組織傾向性表達(dá)模式

5、。選取部分新miRNA進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示其在3個(gè)組織的表達(dá)模式與高通量測序的結(jié)果一致。
　　本部分研究通過高通量測序技術(shù)鑒定了川桑保守miRNA、新miRNA以及其候選靶基因，對桑樹miRNA的功能分析和家蠶體內(nèi)是否有桑樹源miRNA的研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　2.栽培桑miRNA的鑒定及其與野生桑miRNA的比較分析
　　之前我們對川桑（野生桑）葉片進(jìn)行了miRNA的鑒定，但是家蠶攝食的是栽培桑桑葉，于是

6、本部分研究采用solexa測序?qū)蓚€(gè)栽培桑品系（湖桑32號和倫教109）葉片miRNA進(jìn)行鑒定并比較分析了野生桑和栽培桑之間的差異。
　　結(jié)合miRBase的第21版釋放數(shù)據(jù)，共鑒定到兩個(gè)栽培桑品系以及川桑的保守miRNA分別是192個(gè)、180個(gè)和151個(gè)，湖桑32號和倫教109的新miRNA分別是177個(gè)和167個(gè)。三者共有的保守miRNA是137個(gè)，表明野生桑和栽培桑的miRNA種類差異不大。表達(dá)水平差異分析表明野生桑（川桑）

7、和栽培桑（湖桑32號和倫教109）的差異保守miRNA共有100個(gè)，其中75個(gè)miRNA在栽培桑中上調(diào)表達(dá)，25個(gè)下調(diào)表達(dá);差異新miRNA共有266個(gè)，其中89個(gè)新miRNA在栽培桑中上調(diào)表達(dá)，177個(gè)下調(diào)表達(dá)，雖然差異表達(dá)的miRNA數(shù)目較多，但是表達(dá)量高的差異表達(dá)miRNA較少，RPM值在100以上的只有6個(gè)。說明了野生桑（川桑）和兩個(gè)栽培桑miRNA整體的表達(dá)水平大同小異。同時(shí)我們也分析了這些差異miRNA可能與川桑和栽培桑之間

8、的關(guān)系。差異表達(dá)miRNA對應(yīng)靶基因的KEGG分析表明，野生桑和栽培桑參與碳水化合物和氨基酸代謝的差異miRNA對應(yīng)靶基因數(shù)目最多，暗示了二者在糖類和蛋白質(zhì)含量可能有所差異。
　　本部分研究表明栽培桑和野生桑在miRNA的種類和表達(dá)水平上大同小異，說明用川桑數(shù)據(jù)進(jìn)行下一步的分析是可行的。
　　3.家蠶血淋巴小RNA種類的鑒定和分析
　　為探究家蠶體內(nèi)是否有桑樹源miRNA，本部分研究采用高通量測序技術(shù)對家蠶血淋巴小RN

9、A文庫進(jìn)行測序，通過分析共鑒定的小RNA種類包括:桑樹源miRNA，家蠶的miRNA、tsRNA、rRNA、snRNA以及snoRNA。
　　家蠶血淋巴小RNA和桑樹miRNA的比對分析結(jié)果表明，家蠶血淋巴中有8個(gè)桑樹源miRNA，包括mno-miR166b，mno-miR166c，mno-miR167e，mno-miR396b, mno-miR156c,mno-miR398, mno-miR162, mno-miR159a，其總

10、體的表達(dá)量非常低，最高的reads數(shù)只有11。該結(jié)果表明家蠶攝食桑葉后，部分桑樹miRNA能夠穿過家蠶的消化道進(jìn)入家蠶的體內(nèi)，但是由于檢測到的桑樹源miRNA含量較低，也不能排除這一結(jié)果是由于高通量測序帶來的誤差或是樣品收集過程中桑葉帶來的污染。
　　家蠶血淋巴小RNA和已報(bào)道的家蠶miRNA的比對結(jié)果表明，家蠶血淋巴中共有133個(gè)已知miRNA和6個(gè)新miRNA，其整體表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其在家蠶的其它組織（例如脂肪體、絲腺等），推

11、測其原因可能是血淋巴中的miRNA大部分來源于血細(xì)胞中的miRNA和組織細(xì)胞分泌的miRNA。
　　此外，我們還發(fā)現(xiàn)，血淋巴小RNA長度分布結(jié)果表明血淋巴中含量最高的小RNA是tRNA衍生的小RNA(tsRNA)，分別占據(jù)兩個(gè)小RNA文庫總量的86.99％和92.04％，長度分布主要在25-28nt區(qū)間。tsRNA分類結(jié)果表明，家蠶血淋巴中含量前2位分別是tsRNA-Asp(GAC)和tsRNA-His(CAC)。以上兩種tsRN

12、A在其對應(yīng)的tRNA的位置分布結(jié)果表明幾乎99％都位于tRNA的5'端。此外，tsRNA-Asp(GAC)和tsRNA-His(CAC)在家蠶體液和組織中的表達(dá)水平分析表明，這兩個(gè)tsRNA僅在家蠶血淋巴中高量表達(dá)，在全蠶、脂肪體和絲腺中極微量表達(dá)，以上結(jié)果暗示家蠶的tsRNA-Asp(GAC)和tsRNA-His(CAC)可能在血淋巴中起著特殊的作用。
　　該研究利用二代測序法和生物信息學(xué)方法對家蠶血淋巴的小RNA種類進(jìn)行了分析

13、，對家蠶血淋巴中miRNA、tsRNA的功能研究和桑樹源miRNA跨界轉(zhuǎn)運(yùn)到家蠶的研究提供了數(shù)據(jù)支撐。
　　4.桑樹miR166b對家蠶的跨界調(diào)節(jié)研究
　　家蠶血淋巴小RNA和桑樹miRNA的比對分析結(jié)果顯示，家蠶血淋巴中有8個(gè)桑樹源miRNA。本研究對桑樹源的miRNA是否真正進(jìn)入了家蠶體內(nèi)進(jìn)行了驗(yàn)證，并研究了進(jìn)入家蠶體內(nèi)的桑樹源miRNA對家蠶的生理功能是否有作用。
　　莖環(huán)PCR、T-A克隆和Sanger測序結(jié)果

14、顯示:7個(gè)桑樹源的miRNA(mno-miR166b,mo-miR166c,mno-miR167e,mno-miR396b,mno-miR156c,mno-miR398和mno-miR159a)進(jìn)入了家蠶的血淋巴中，通過與對照miR169a的測序頻率比較，證明了這7個(gè)桑樹源miRNA不是來自大規(guī)模測序的污染，也非樣品收集過程中桑葉帶來的污染，是真實(shí)存在家蠶的血淋巴中。此外，克隆測序結(jié)果表明桑樹源的4個(gè)miRNA(mno-miR166b，

15、mno-miR166c，mno-miR167e和mno-miR396b)能進(jìn)入家蠶的9個(gè)組織（脂肪體、絲腺、腦、卵巢、中腸、涎腺、精巢、前胸腺和馬氏管）。微滴數(shù)字化PCR(ddPCR)結(jié)果表明人工合成的miR166b在被家蠶攝食后，能進(jìn)入家蠶的血淋巴和脂肪體中，然而該miRNA僅能在家蠶體內(nèi)持續(xù)保持約3小時(shí)便被降解。
　　RT-PCR結(jié)果表明miR166b的11個(gè)候選靶基因在喂食人工合成miR166b前后的表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化，暗

16、示了miR166b在家蠶中沒有功能或是這11個(gè)基因不是miR166b的靶基因。轉(zhuǎn)錄組測序的進(jìn)一步分析結(jié)果表明，5齡2天的雄蠶被喂食人工合成的miR166b之后與其被喂食前相比較，全蠶的整個(gè)轉(zhuǎn)錄組共有30個(gè)差異表達(dá)基因，其中17個(gè)上調(diào)基因，13個(gè)下調(diào)基因。基因分類表明共有12個(gè)基因涉及免疫和響應(yīng)壓力，占據(jù)30個(gè)差異表達(dá)基因的40％，我們推測通過攝食進(jìn)入家蠶體內(nèi)的人工合成miR166b可能激發(fā)了家蠶抵抗非自我分子。6個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs

17、)的RT-PCR結(jié)果顯示其中有3個(gè)DEGs在喂食了人工合成miR166c和/或miR167e后上調(diào)和/或下調(diào)表達(dá)，該結(jié)果暗示了轉(zhuǎn)錄組測序得到的12個(gè)與免疫和壓力相關(guān)的DEGs表達(dá)水平變化的發(fā)生不是由于喂食的miR166b的序列引起，而是miR166b這種核酸物質(zhì)造成的。表型調(diào)查表明喂食miR166b和沒有喂食miR166b的家蠶在幼蟲重量的增加倍數(shù)、進(jìn)入熟蠶期的比率、致死率、蛹和繭殼重量等方面沒有顯著差異。此外，我們還預(yù)測了miR166

18、b在30個(gè)差異表達(dá)基因中是否有作用的靶位點(diǎn)，結(jié)果表明沒有重要的靶位點(diǎn)。以上結(jié)果都表明了桑樹miR166b對家蠶的生理活動(dòng)基本沒有影響。
　　綜合上文高通量測序、克隆測序?qū)嶒?yàn)、ddPCR檢測以及喂食人工合成miR166b的轉(zhuǎn)錄組分析、RT-PCR檢測和表型調(diào)查的結(jié)果，我們認(rèn)為桑葉中的miRNAs能通過家蠶攝食桑葉的方式進(jìn)入家蠶的血淋巴和9個(gè)組織中，人工合成miR166b也能進(jìn)入家蠶的血淋巴和脂肪體，然而喂食的人工合成miR166b對