參與先天性免疫應(yīng)答的miRNA的鑒定及其功能的初步研究.pdf

1、microRNA(miRNA)是一類由基因組編碼的長(zhǎng)度為18～26個(gè)核苷酸的單鏈非編碼小RNA，它們廣泛存在于真核細(xì)胞中，在進(jìn)化上高度保守。在RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ的作用下，miRNA以前體的形式從基因組中轉(zhuǎn)錄出來。它的形成過程涉及一系列蛋白分子對(duì)其轉(zhuǎn)錄前體的剪切和轉(zhuǎn)運(yùn)，最終成熟的miRNA在細(xì)胞質(zhì)中與其它相關(guān)蛋白分子一起構(gòu)成沉默復(fù)合體(RISC)，通過與靶mRNA分子的3’UTR中相應(yīng)序列的結(jié)合，導(dǎo)致靶mRNA的降解或者轉(zhuǎn)錄后翻譯受到抑制

2、。到目前為止，已在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)上萬種的miRNA，它們構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，參與細(xì)胞增殖分化、生物體發(fā)育、機(jī)體免疫應(yīng)答和腫瘤發(fā)生等生理及病理過程。
　　 當(dāng)病原微生物入侵時(shí)，機(jī)體的先天性免疫應(yīng)答會(huì)被迅速激活，并通過其介導(dǎo)的炎癥和抗病毒反應(yīng)來殺滅和清除病原微生物。NF-κB是先天性免疫應(yīng)答過程中的一個(gè)重要信號(hào)通路，當(dāng)它被激活時(shí)，能夠啟動(dòng)下游一系列細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)機(jī)體的炎癥反應(yīng)的發(fā)生，與此同時(shí)先天性免疫應(yīng)答誘導(dǎo)產(chǎn)生的Ⅰ型

3、干擾素在機(jī)體的抗病毒反應(yīng)中也發(fā)揮了重要作用。宿主的抗感染先天性免疫應(yīng)答一方面要產(chǎn)生足夠強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)以徹底消滅入侵的病原微生物，另一方面又要防止這一反應(yīng)的過度激活而對(duì)機(jī)體本身帶來的損傷。在這一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，存在著許多正負(fù)調(diào)控因子，以保障機(jī)體先天性免疫應(yīng)答的適度激活。越來越多的文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA參與了先天性免疫應(yīng)答，并發(fā)揮重要的調(diào)控作用。發(fā)現(xiàn)和鑒定參與調(diào)控先天性免疫應(yīng)答的miRNA及對(duì)其分子機(jī)制的研究，可以加深對(duì)宿主先天性免疫應(yīng)答調(diào)控的

4、理解，為研制抗感染藥物提供新的靶標(biāo)。
　　 在本課題中，我們初步鑒定出了38種可能調(diào)控先天性免疫應(yīng)答信號(hào)通路的miRNA，并對(duì)其中的miR-526a、miR-617和miR-623進(jìn)行了進(jìn)一步的功能研究。
　　 1、高通量篩選參與先天性免疫應(yīng)答的miRNA：
　　 通過IFNβ和IL-1β(NF-κB調(diào)控的細(xì)胞因子)的檢測(cè)平臺(tái)，對(duì)140個(gè)miRNA進(jìn)行篩選，從中鑒定出了38種參與先天性免疫應(yīng)答的功能miRNA。其

5、中21種能夠上調(diào)IFNβ的表達(dá)水平，22種能夠上調(diào)IL-1β的表達(dá)水平。
　　 2、miR-526a在先天性免疫應(yīng)答中功能的初步研究：
　　 通過熒光素酶報(bào)告基因和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-526a能夠明顯上調(diào)IFNβ和IL-1β的表達(dá)水平。因此，我們進(jìn)一步研究了miR-526a在宿主先天性免疫應(yīng)答中的作用。通過熒光定量PCR的方法，我們發(fā)現(xiàn)在VSV和LPS誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞的過程中，miR-526a的表達(dá)水平隨著時(shí)

6、間的變化逐漸增強(qiáng)，這說明miR-526a可能參與了病原體感染的宿主免疫應(yīng)答。接下來，通過生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)到CYLD可能是miR-526a的靶點(diǎn)。通過熒光定量PCR的方法，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中過表達(dá)miR-526a能夠在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上抑制CYLD的表達(dá)。CYLD是一個(gè)去泛素化酶，能夠通過對(duì)RIG-1的去泛素化作用抑制RIG-1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；同時(shí)它還能夠通過與MyD88的相互作用抑制其對(duì)下游分子的磷酸化進(jìn)而負(fù)調(diào)控TLR4信號(hào)通路，從而下調(diào)宿主

7、先天性免疫應(yīng)答水平。上述結(jié)果初步證明miR-526a可能通過負(fù)調(diào)控CYLD的表達(dá)水平促進(jìn)IFNβ和IL-1β的產(chǎn)生。
　　 3、參與炎癥反應(yīng)的miR-617和miR-623在腫瘤發(fā)生中功能的初步研究：
　　 通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-617和miR-623能夠明顯上調(diào)IL-1β的表達(dá)水平，而IL-1β是受NF-κB調(diào)控的最重要的細(xì)胞因子之一。NF-κB信號(hào)通路在先天性免疫促炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。大量研究表明

8、，在腫瘤的發(fā)生過程中，常伴有NF-κB信號(hào)通路特征性的表達(dá)變化，其中炎癥相關(guān)分子參與了腫瘤的發(fā)生，并在腫瘤形成的不同階段起著決定性的作用。IL-1β是一個(gè)前炎癥因子，它介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)所產(chǎn)生的微環(huán)境能夠?qū)е抡＜?xì)胞突變同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞的增殖。其它相關(guān)課題的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-617和miR-623在乳腺癌發(fā)生過程中表達(dá)增高，因此我們探討了miR-617和miR-623在乳腺癌發(fā)生中的作用。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)和劃痕實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞系ZR-7

9、5-1中過表達(dá)miR-617和miR-623能夠?qū)е履[瘤細(xì)胞增殖和遷移能力的顯著增加。上述結(jié)果表明miR-617和miR-623可能通過影響細(xì)胞的炎癥反應(yīng)參與腫瘤的發(fā)生，為我們進(jìn)一步研究miR-617和miR-623的功能打下了基礎(chǔ)。
　　 綜上所述，本課題初步鑒定了38種可能參與先天性免疫應(yīng)答的miRNA，進(jìn)一步研究表明，miR-526a可能通過抑制負(fù)調(diào)控因子CYLD從而上調(diào)IFNβ和IL-1β的表達(dá)水平；此外參與炎癥反應(yīng)的m