四株蘇云金芽孢桿菌殺蟲基因和功能蛋白多樣性分析.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)自上世紀(jì)初被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已成為微生物農(nóng)藥中的重要一員，為有害生物的綜合防治作出了重要貢獻(xiàn)。從1938年第一個(gè)Bt制劑問(wèn)世以來(lái)，有文獻(xiàn)報(bào)道，其在微生物農(nóng)藥中所占份額達(dá)90％以上。蘇云金芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種毒素對(duì)昆蟲、線蟲和哺乳動(dòng)物有毒害作用，而且可以對(duì)人類的某些疾病治療有幫助。本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期從新疆馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa decemlineata）上分離獲得

2、的4個(gè)具有幾丁質(zhì)酶活性的Bt菌株進(jìn)行了殺蟲功能基因和蛋白研究。利用PCR-RFLP(Polymerase ChainReaction-Restriction Fragment Length Polymorphism)和特異性PCR方法，對(duì)4個(gè)Bt菌株所含有的殺蟲基因進(jìn)行鑒定，分析它們的功能蛋白，并測(cè)定它們對(duì)柑桔小實(shí)蠅等害蟲的控制作用。
　　1、殺蟲基因的鑒定分析
　　根據(jù)殺蟲基因cry1-10的保守區(qū)域設(shè)計(jì)通用引物，再按照引

3、物上加入的酶切位點(diǎn)堿基序列選擇相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，從限制性片段多態(tài)性圖譜（RFLP圖譜）分析其基因類型。結(jié)果表明，菌株CPB008和CPB012均含有cry1和cry2基因。將K5un3/K3un3引物擴(kuò)增到的cry1基因，用PstⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切，得到1117bp，801 bp，518bp和322bp的序列。將S5un2/S3un2擴(kuò)增得到的cry2基因用HincⅡ和MspⅠ進(jìn)行酶切，得到958 bp，79

4、1 bp，297bp和273bp等特異性條帶。CPB016和CPB111兩個(gè)菌株未檢測(cè)到cry1-10基因。再通過(guò)設(shè)計(jì)二級(jí)分類基因特異性引物cry1A、cry1B等，鑒定菌株所含具體基因型。結(jié)果表明，CPB008含有cry1Aa、cry1Ac（GenBank登錄號(hào):KR049190）、cry1Ia、cry2Aa(KR049192)和cry2Ab(KR049193);CPB012含有cry1Aa(KR049191)、cry1Ac、cry1

5、Ia(KJ941157)、cry2Aa(KR049194)和cry2Ab(KR049195)殺蟲功能基因。其中對(duì)具有雙元活性的cry1Ⅰa基因設(shè)計(jì)全長(zhǎng)序列引物，擴(kuò)增獲得2159 bp(CPB012)全長(zhǎng)基因（KJ941157），其結(jié)構(gòu)完整。在對(duì)cry11-cry40、vip1-3、cyt1-2基因的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，CPB008和CPB016還含有vip3A基因，GenBank登錄號(hào)分別是:KR049196和KR049197。而CPB016和

6、CPB111未檢測(cè)到相關(guān)基因。cry11-40，cyt1-2以及vip1-3基因檢測(cè)參照普通PCR方法，結(jié)果顯示4個(gè)菌株除CPB008和CPB012含有vip3A基因外，其它基因均無(wú)特異性條帶。
　　2、晶體蛋白的形態(tài)觀察與SDS-PAGE
　　連續(xù)培養(yǎng)觀察不同時(shí)間菌體和晶體蛋白形態(tài)顯示，CPB008能夠產(chǎn)生菱形、不規(guī)則形和球形晶體。CPB012能夠產(chǎn)生方形、不規(guī)則形和球形晶體，而CPB016和CPB111能夠產(chǎn)生球形晶體。

7、蛋白晶體分離后進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明，CPB008能夠產(chǎn)生135-140 kDa、80 kDa、70 kDa的特異性蛋白條帶，CPB012能夠產(chǎn)生135-140 kDa、80 kDa和70 kDa特異性條帶，而CPB016和CPB111未見(jiàn)上述蛋白條帶，與基因型測(cè)定結(jié)果吻合。
　　3、對(duì)柑桔小實(shí)蠅（Bactrocera dorsalis）殺蟲效果測(cè)定
　　四個(gè)菌株對(duì)雙翅目害蟲柑桔小實(shí)蠅(Bactrocera do

8、rsalis)2齡幼蟲的生測(cè)實(shí)驗(yàn)表明，被感染試蟲與正常試蟲相比，逐漸停止攝食，蟲體中部先發(fā)黑，最后蟲體全身發(fā)黑腐爛。CPB008和CPB012菌株接種后7d的累計(jì)死亡率LR7d分別為70.86％和76.72％，而CPB016和CPB111組未見(jiàn)幼蟲死亡，蟲體順利化蛹。CPB008的LT50為3.1d，CPB012的LT50為2.4 d。CPB008的致死中濃度LC50為9.96×107 cells/mL, CPB012的致死中濃度LC5

9、0為2.03×107 cells/mL。由此判斷CPB012在4個(gè)菌株中，對(duì)雙翅目柑桔小實(shí)蠅生物毒性最高。
　　結(jié)合本實(shí)驗(yàn)前期用4個(gè)菌株對(duì)鱗翅目家蠶(Bombyx mori)和鞘翅目馬鈴薯甲蟲的生物測(cè)定試驗(yàn)，最終判斷它們均具有幾丁質(zhì)酶活性，當(dāng)試蟲是家蠶和馬鈴薯甲蟲時(shí)，CPB008效果最好，當(dāng)試蟲是柑桔小實(shí)蠅時(shí)，CPB012效果最好。這也與CPB008和CPB012具有的多個(gè)cry1類和cry2類殺蟲功能基因相符合。而CPB016和

10、CPB111對(duì)家蠶和馬鈴薯甲蟲具有一定的毒性，但是對(duì)于柑桔小實(shí)蠅不具有明顯毒殺作用，可能是兩菌株不能產(chǎn)生對(duì)雙翅目專一性的殺蟲蛋白所致。
　　綜上所述，來(lái)自于馬鈴薯甲蟲的蘇云金芽孢桿菌CBP008和CPB012菌株含有cry1類和cry2和vip3A類殺蟲功能基因，可能調(diào)控合成了135-140 kDa、80 kDa和70 kDa的相應(yīng)殺蟲功能蛋白，因此對(duì)雙翅目柑桔小實(shí)蠅、鞘翅目馬鈴薯甲蟲及鱗翅目家蠶都具有很強(qiáng)的毒殺作用，在作物害蟲的