眼科表面麻醉劑愛爾卡因和鹽酸奧布卡因?qū)θ私悄?nèi)皮細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用研究.pdf

1、眼科表面麻醉劑隨著眼科手術(shù)技術(shù)和設(shè)備的發(fā)展得到了越來越廣泛的應(yīng)用，因此，其對(duì)角膜的毒副作用越來越得到大家的關(guān)注，其中，最常用的兩種表面麻醉劑是愛爾卡因和鹽酸奧布卡因。角膜主要由內(nèi)皮、基質(zhì)、上皮及其衍生物組成，而哺乳動(dòng)物(除兔以外)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞在成年后即失去再生能力，因此，人角膜內(nèi)皮細(xì)胞(HCEC)的損傷是不可修復(fù)的，對(duì)于HCEC的研究更是重中之重。目前，關(guān)于眼科表面麻醉劑對(duì)HCEC影響作用的研究主要是通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，耗資大耗時(shí)多，在

2、很大程度上制約了研究的范圍及進(jìn)程，而至今仍未見有關(guān)用HCEC進(jìn)行體外表麻研究的報(bào)道。本文以人角膜內(nèi)皮細(xì)胞系(HCEC細(xì)胞系)為體外研究體系研究了愛爾卡因和鹽酸奧布卡因?qū)CEC的影響作用，為了進(jìn)一步證明這兩種麻醉劑對(duì)于活體HCEC的毒副作用，本文選用愛爾卡因?yàn)檠芯繉?duì)象，以家貓為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行了體內(nèi)毒性柞用研究，最終根據(jù)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果準(zhǔn)確評(píng)價(jià)出這兩種表面麻醉劑對(duì)HCEC的毒副作用，進(jìn)一步為愛爾卡因和鹽酸奧布卡因的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依

3、據(jù)。
　　 體外培養(yǎng)的HCEC經(jīng)156.25 mg/L～5 g/L梯度稀釋的愛爾卡因處理后的光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，濃度高于312.5 mg/L的愛爾卡因，可引起HCEC出現(xiàn)細(xì)胞皺縮、胞內(nèi)空泡化、脫落和死亡等變化，而濃度低于156.25mg/L班刪細(xì)胞形態(tài)變化不顯著，證明愛爾卡因在濃度高于312.5 mg/L時(shí)對(duì)HCEC具有顯著的細(xì)胞毒性。156.25 mg/L～5 g/L梯度稀釋的愛爾卡因處理組HCEC的吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)熒

4、光雙染色結(jié)果表明，HCEC的凋亡率具有濃度和時(shí)間依賴性，2.5 g/L和5 g/L愛爾卡因處理組HCEC分別于24 h和16 h后細(xì)胞凋亡率達(dá)100％，312.5 mg/L、625 mg/L、1.25g/L愛爾卡因處理組HCEC的凋亡率在12 h時(shí)達(dá)到最高，分別為17.9％、49.2％和58.5％，從而證明愛爾卡因在濃度高于312.5 mg/L時(shí)能顯著誘導(dǎo)HCEC質(zhì)膜通透性的增大。312.5 mg/L～5 g/L愛爾卡因處理組HCEC的

5、DNA樣品瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，625mg/L～5g/L愛爾卡因處理組的HCEC，其DNA出現(xiàn)了典型的梯狀條帶，證明愛爾卡因在濃度高于625 mg/L時(shí)能顯著誘導(dǎo)HCEC發(fā)生DNA斷片化，而濃度低于312.5 mg/L時(shí)其DNA未出現(xiàn)梯狀條帶。1.25 g/L，愛爾卡因處理12 h后的HCEC樣品的透射電鏡觀察結(jié)果顯示，其細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)了胞質(zhì)空泡化、染色質(zhì)固縮在核內(nèi)邊緣化及凋亡小體形成等顯著的細(xì)胞凋亡特征，證明1.25 g/L愛爾

6、卡因處理后的HCEC具有細(xì)胞凋亡的超微結(jié)構(gòu)特征。上述研究結(jié)果證實(shí)，愛爾卡因在濃度高于312.5 mg/L時(shí)能顯著誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的HCEC發(fā)生凋亡。
　　 7.8125 mg/L～4 g/L鹽酸奧布卡因?qū)w外培養(yǎng)的HCEC影響作用的研究結(jié)果顯示，光鏡下，濃度高于62.5 mg/L鹽酸奧布卡因處理的HCEC出現(xiàn)了細(xì)胞皺縮、胞內(nèi)空泡化、脫落和死亡等現(xiàn)象，而濃度低于31.25 mg/L時(shí)細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量無顯著變化，證明鹽酸奧布卡因在濃度高于

7、62.5 mg/L時(shí)對(duì)HCEC具有顯著的細(xì)胞毒性。AO/EB熒光雙染色結(jié)果顯示，HCEC的細(xì)胞凋亡率的變化具有濃度和時(shí)間依賴性，125 mg/L～4 g/L鹽酸奧布卡因處理組HCEC的凋亡率均隨濃度的增大和時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，均在不同時(shí)間內(nèi)達(dá)到100％，62.5 mg/L鹽酸奧布卡因處理組的HCEC在12 h時(shí)凋亡率達(dá)到最高，證明鹽酸奧布卡因在濃度高于62.5 mg/L時(shí)能顯著誘導(dǎo)HCEC質(zhì)膜通透性的增大。125 mg/L～4g/L鹽

8、酸奧布卡因處理組HCEC在DNA瓊脂糖凝膠電泳中出現(xiàn)了典型的梯狀條帶，證明鹽酸奧布卡因在濃度高于125 mg/L時(shí)能顯著誘導(dǎo)HCEC發(fā)生DNA斷片化，而濃度低于62.5 mg/L時(shí)其DNA未出現(xiàn)梯狀條帶。125 mg/L鹽酸奧布卡因處理16 h后的HCEC樣品的透射電鏡觀察結(jié)果顯示，其細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)了胞內(nèi)空泡化、染色質(zhì)固縮在核內(nèi)邊緣化和凋亡小體形成等顯著的細(xì)胞凋亡特征，證明125 mg/L鹽酸奧布卡因處理后的HCEC具有細(xì)胞凋亡的超

9、微結(jié)構(gòu)特征。綜合上述研究結(jié)果，證實(shí)鹽酸奧布卡因在濃度高于62.5 mg/L時(shí)能顯著誘導(dǎo)體外培養(yǎng)HCEC發(fā)生細(xì)胞凋亡。
　　 為了驗(yàn)證這兩種表面麻醉劑在活體中對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞具有凋亡誘導(dǎo)作用，本文選取愛爾卡因進(jìn)行了家貓角膜的在體檢測(cè)和離體鑒定。按照愛爾卡因的臨床使用濃度5 g/L表面麻醉家貓眼球，每5 d進(jìn)行內(nèi)皮鏡檢測(cè)，結(jié)果顯示，表面麻醉5 d后，實(shí)驗(yàn)眼角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度減少，角膜內(nèi)皮細(xì)胞平均面積增大，均與對(duì)照眼差異顯著(P<0.05

10、)，CV值上升，六角形細(xì)胞比率下降，但與對(duì)照眼相比差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表面麻醉25 d后，實(shí)驗(yàn)眼各指標(biāo)變化均趨于平緩。表面麻醉40 d后取家貓角膜進(jìn)行離體鑒定，茜素紅染色結(jié)果顯示，家貓實(shí)驗(yàn)眼角膜內(nèi)皮細(xì)胞六角形比率明顯下降，部分區(qū)域細(xì)胞面積明顯變大。掃描電鏡結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)眼角膜有少量?jī)?nèi)皮細(xì)胞皺縮，細(xì)胞發(fā)生凋亡。綜合以上研究結(jié)果，證實(shí)5 g/L愛爾卡因表面麻醉確對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞具有凋亡誘導(dǎo)作用。
　　 本文以非轉(zhuǎn)染HCE

11、C細(xì)胞系為理想的體外研究體系，探討了愛爾卡因和鹽酸奧布卡因?qū)CEC的凋亡誘導(dǎo)作用，證實(shí)了愛爾卡因和鹽酸奧布卡因能夠誘導(dǎo)HCEC發(fā)生凋亡，并通過愛爾卡因的家貓?jiān)隗w實(shí)驗(yàn)和家貓角膜離體鑒定驗(yàn)證了愛爾卡因臨床使用濃度確可引起角膜內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，對(duì)角膜內(nèi)皮紐胞具有較大的毒性作用。因此，臨床應(yīng)用時(shí)應(yīng)避免使用愛爾卡因和鹽酸奧布卡因，或使用無毒副作用的眼科表面麻醉劑。同時(shí)，本文利用HCEC細(xì)胞系為模型為無毒副作用的眼科表面麻醉劑的研發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)