眼科抗菌藥物加替沙星和利福平對人角膜上皮細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用研究.pdf

1、人的角膜位于眼球的最前端，而角膜上皮層又位于角膜的最外側(cè)，是抵御外界病原體入侵的第一道防線，極易受到感染，引發(fā)角膜炎癥，影響患者視力的準(zhǔn)確性。加替沙星和利福平是目前眼科中治療角膜炎癥常用的抗生素類抗菌藥物，隨著應(yīng)用的普及，加替沙星和利福平是否具有細(xì)胞毒性作用等問題引起越來越多的關(guān)注和重視，越來越多的研究建議降低使用濃度和劑量。但目前仍未見有關(guān)于加替沙星和利福平對人角膜上皮(HCEP)細(xì)胞毒性作用的詳細(xì)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室自建的非轉(zhuǎn)染、無

2、致瘤性的HCEP細(xì)胞系為研究體系，研究了加替沙星和利福平對HCEP細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。
　　為了驗(yàn)證加替沙星對HCEP細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用，本文將臨床濃度的加替沙星溶液(3 g/L)倍比稀釋至0.1875 g/L，對體外培養(yǎng)的HCEP細(xì)胞加藥處理后發(fā)現(xiàn)濃度高于0.75 g/L的加替沙星會導(dǎo)致HCEP細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞發(fā)生皺縮變圓，甚至脫壁死亡。這說明0.75～3 g/L濃度的加替沙星對HCEP細(xì)胞有比較明顯的毒性作用，且具有

3、時間和濃度依賴性。為了探究加替沙星對HCEP細(xì)胞的毒性作用機(jī)理，本文用0.1875～3 g/L梯度稀釋的加替沙星處理HCEP細(xì)胞，然后進(jìn)行吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)熒光雙染色實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)濃度高于0.75 g/L時加替沙星能顯著提高HCEP細(xì)胞質(zhì)膜的通透性，且加替沙星對HCEP細(xì)胞的毒性作用有明顯的濃度和時間依賴性，提示這種毒性作用可能是凋亡誘導(dǎo)作用。通過對加替沙星處理后的HCEP細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)，1.5 g

4、/L的加替沙星處理HCEP細(xì)胞28h和32h均出現(xiàn)了典型、清晰的梯狀條帶，細(xì)胞核DNA發(fā)生大規(guī)模片段化。透射電鏡觀察結(jié)果顯示細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡化，染色質(zhì)出現(xiàn)固縮并邊緣化，并有凋亡小體的形成等典型的細(xì)胞凋亡特征,表明加替沙星對 HCEP細(xì)胞的毒性作用是凋亡誘導(dǎo)作用。進(jìn)行Annexin-VFITC檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，1.5 g/L加替沙星處理4h后的HCEP細(xì)胞即進(jìn)入早期凋亡狀態(tài)，24h后大部分細(xì)胞進(jìn)入晚期凋亡狀態(tài)。通過檢測加替沙星處

5、理后的HCEP細(xì)胞的線粒體膜電位，發(fā)現(xiàn)HCEP細(xì)胞線粒體膜電位會被去極化，揭示HCEP細(xì)胞在加替沙星的誘導(dǎo)下可能通過線粒體途徑發(fā)生凋亡。
　　為驗(yàn)證利福平對 HCEP細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用，本文將臨床濃度的利福平溶液(0.5 g/L)倍比稀釋到31.25 mg/L，對體外培養(yǎng)的HCEP細(xì)胞進(jìn)行處理后，觀察發(fā)現(xiàn)利福平濃度高于0.125 g/L時，HCEP細(xì)胞皺縮，出現(xiàn)明顯的空泡化，甚至脫壁等現(xiàn)象,表明濃度高于0.125 g/L的利福平溶

6、液對HCEP細(xì)胞有顯著的毒性作用，且有明顯的時間和濃度依賴性。為了進(jìn)一步研究利福平對HCEP細(xì)胞毒性作用的機(jī)理，本文對利福平處理過的HCEP細(xì)胞進(jìn)行AO/EB熒光雙染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HCEP細(xì)胞的質(zhì)膜通透性顯著提高，提示利福平對HCEP細(xì)胞的毒性作用可能是凋亡誘導(dǎo)作用。通過DNA瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過0.5 g/L的利福平處理32 h后的HCEP細(xì)胞基因組DNA出現(xiàn)了清晰典型的梯狀條帶，細(xì)胞核DNA發(fā)生大規(guī)模片段化。電鏡下HCEP細(xì)胞呈現(xiàn)出

7、結(jié)構(gòu)紊亂、空泡化、染色質(zhì)邊緣化等凋亡特征，揭示利福平對HCEP細(xì)胞的毒性作用是凋亡誘導(dǎo)作用。流式細(xì)胞儀的檢測結(jié)果表明，1.5 g/L的利福平處理6h后的HCEP細(xì)胞即進(jìn)入早期凋亡狀態(tài)，24h后大部分HCEP細(xì)胞進(jìn)入了晚期凋亡狀態(tài)。而線粒體膜電位的檢測結(jié)果表明，HCEP細(xì)胞在利福平誘導(dǎo)下線粒體膜電位被去極化，其凋亡與線粒體相關(guān)。
　　本文以自主建立的非轉(zhuǎn)染、無致瘤性的HCEP細(xì)胞系為研究體系，進(jìn)行了眼科抗菌藥物加替沙星和利福平對HC