無(wú)籽刺梨RksAGL基因克隆與功能分析.pdf

1、本研究以無(wú)籽刺梨（Rosa kweichonensisvar.sterilis）花芽為材料，采用同源克隆結(jié)合cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE）從無(wú)籽刺梨中克隆得到AGL基因的cDNA全長(zhǎng)，命名為RksAGL。對(duì)該基因進(jìn)行生物信息學(xué)和時(shí)空表達(dá)分析。構(gòu)建RksAGL基因植物表達(dá)載體pSH-35S-RksAGL，通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化煙草。獲得研究結(jié)果如下：
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2、、通過(guò)RACE技術(shù)克隆RksAGL基因的cDNA，全長(zhǎng)1089 bp，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為747 bp，編碼248個(gè)氨基酸的蛋白。
　　2、RksAGL蛋白分子量約為28.56 kDa，理論等電點(diǎn)為9.40，是親水性蛋白，無(wú)信號(hào)肽序列，RksAGL基因編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主，占56.05％；其次為無(wú)規(guī)則卷曲占29.44%；延伸鏈占10.89%；β-轉(zhuǎn)角占3.63%。分析RksAGL基因序列發(fā)現(xiàn)其編碼的蛋白含有MADS box

3、結(jié)構(gòu)域和K box域，還有C類基因特有的AG motifⅠ和AG motifⅡ，屬于MADS-box蛋白的TypeⅡ類型。Blast比對(duì)結(jié)果顯示無(wú)籽刺梨RksAGL基因編碼的氨基酸序列與玫瑰 AGL基因編碼的氨基酸序列（AAD00025.1、BAA90744.1、BAA90746.1和BAA90745.1）一致性在99%以上，與草莓AGL基因編碼的氨基酸序列（AAD45814.1）一致性為91%，與煙草AGL基因編碼的氨基酸序列（AAA

4、17033.1）一致性為68%。通過(guò)分析可認(rèn)為RksAGL基因是無(wú)籽刺梨的AGAMOUS（AG）基因，歸屬于C類基因euAG進(jìn)化系的成員。
　　3、實(shí)時(shí)定量PCR分析表明RksAGL基因僅在雄蕊和心皮中表達(dá)，在萼片和花瓣中未檢測(cè)到該基因的表達(dá)信號(hào)，而且，RksAGL基因在心皮的表達(dá)量是雄蕊表達(dá)量的1.6倍。
　　4、在初始載體pSH737的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了RksAGL基因的雙子葉植物表達(dá)載體pSH-35S-RksAGL，并使用