非小細胞肺癌PBK-TOPK與Ki-67及p53表達的關系及預后意義.pdf

1、研究背景:
　　 近年的研究表明肺癌已成為世界上最常見的惡性腫瘤之一，其中非小細胞肺癌(NSCLC)占肺癌的80％～85％。一直以來，對肺癌的早期診斷及治療缺乏有效的手段，手術切除、化療和放療是非小細胞肺癌患者治療的主要方式。然而，患者術后的生存情況并不理想，5年的生存率不足20％，腫瘤轉移及復發(fā)決定著患者術后的生存。因此，研究與肺癌發(fā)生、發(fā)展及轉移相關的分子標志物，探討其作用機制對肺癌的早期診斷、治療及預后評估具有極其重要的意

2、義。
　　 PBK/TOPK(PDZ-binding kinase/T-LAK cell-originated protein kinase)是一種新穎的蛋白激酶，最早于淋巴因子激活的殺傷性T細胞(T-LAK)中發(fā)現(xiàn)，具有322個氨基酸，與惡性腫瘤的增殖調(diào)控密切相關，在惡性腫瘤中呈高表達，除正常睪丸組織和一些胚胎組織外，其它正常組織中均難以檢測到其表達。
　　 Ki-67是一種較為常見的細胞增殖標記物，現(xiàn)廣泛應用于臨床病

3、理診斷中。p53基因是一種抑癌基因，分為野生型及突變型兩種亞型，其中野生型p53可調(diào)節(jié)DNA的修復及細胞的凋亡，突變型p53與腫瘤的形成密切相關。關于PBK/TOPK在非小細胞肺癌中的作用機制是否與Ki-67及p53有關，未見相關報道，為此我們進行了研究。
　　 研究目的及內(nèi)容:
　　 1.探討PBK/TOPK在非小細胞肺癌中的表達及其預后意義;
　　 2.探討PBK/TOPK與Ki-67及p53在非小細胞肺癌中

4、表達的相關性及其預后意義;
　　 3.探討PBK/TOPK下調(diào)對非小細胞肺癌細胞遷移、增殖及存活能力的影響;
　　 4.探討PBK/TOPK在非小細胞肺癌細胞中的表達與Ki-67及p53的關系;
　　 材料及方法:
　　 1.PBK/TOPK在正常肺組織、肺良性病變、非小細胞肺癌原發(fā)灶及淋巴結轉移灶中的表達及其預后意義分析
　　 免疫組化SP法檢測30例正常成人肺組織、30例肺良性病變、279例非

5、小細胞肺癌原發(fā)灶及32例淋巴結轉移灶中PBK/TOPK蛋白的表達;用計算機ImageproPlus6.0(IPP)圖像分析軟件定量測試蛋白表達的陽性單位（PU值），結合臨床相關病理資料及隨訪資料進行統(tǒng)計學分析及術后生存分析。
　　 2.PBK/TOPK與Ki-67及p53在非小細胞肺癌中表達的相關性及其預后意義分析
　　 免疫組化SP法檢測279例非小細胞肺癌組織中PBK/TOPK、Ki-67及p53蛋白的表達，采用半定

6、量方法對免疫組化結果進行分析，探討PBK/TOPK蛋白與Ki-67及p53蛋白表達的相關性，結合臨床相關病理資料及隨訪資料進行術后生存分析。
　　 半定量分析方法及參考標準:陰性:無色或淡黃色;陽性:棕黃色或棕褐色;分別統(tǒng)計PBK/TOPK、Ki-67及p53在非小細胞肺癌組織中陽性表達細胞的百分比，取其平均值作為半定量判定的臨界值。
　　 3.PBK/TOPK下調(diào)對非小細胞肺癌細胞遷移、增殖及存活能力的影響
　　

7、 實驗分為干擾組和對照組，選用PBK/TOPK高表達的A549和GLC-82兩株腺癌細胞同時進行。干擾組采用siRNA干擾片段對兩株細胞中PBK/TOPK的表達進行干擾，使PBK/TOPK表達明顯下調(diào)，對照組未進行任何處理。通過劃痕實驗和Transwell實驗檢測PBK/TOPK下調(diào)后細胞的遷移能力，同時采用四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法及臺盼藍染色法檢測PBK/TOPK下調(diào)后細胞的增殖及存活能力。
　　 4.PBK/TOPK

8、在非小細胞肺癌細胞中的表達與Ki-67及p53的關系
　　 采用四株肺癌細胞，其中包括3株肺腺癌細胞（A549、GLC-82和H358）及1株大細胞肺癌細胞(H460)，通過熒光定量PCR(QRT-PCR)、免疫印跡(Western blot)及細胞滴片免疫組化法檢測四種細胞株中PBK/TOPK和p53的表達。同時采用細胞滴片免疫組化法檢測Ki-67蛋白的表達，采用IPP圖像分析軟件定量檢測蛋白表達的陽性單位（PU值）。對PBK

9、/TOPK表達較高的兩株細胞株進行siRNA干擾，采用QRT-PCR和Western blot驗證其干擾效率，再分別檢測Ki-67及p53的表達，探討PBK/TOPK下調(diào)是否會影響Ki-67及p53的表達。
　　 5.統(tǒng)計學分析
　　 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。兩樣本均數(shù)間的比較采用獨立樣本t檢驗。多樣本均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，若方差齊，組間多重比較采用LSD，若方差不齊，組間的多重比較采用Dunn

10、ett's T3檢驗。采用Spearman秩相關進行相關分析。術后總體生存率的比較采用Pearsonx2檢驗，利用Kaplan-Meier法log rank檢驗進行單因素生存分析，多因素生存分析采用Cox比例風險回歸模型。
　　 結果:
　　 1.PBK/TOPK在正常肺組織、肺良性病變、非小細胞肺癌原發(fā)灶及淋巴結轉移灶中的表達及其預后意義分析
　　 免疫組化定量分析表明PBK/TOPK在正常肺組織、肺良性病變、

11、非小細胞肺癌原發(fā)灶及淋巴結轉移灶中的表達差異具有非常的顯著性(P=0.000)，其中淋巴結轉移灶中PBK/TOPK表達的PU值高于原發(fā)灶、肺良性病變及正常肺組織。PBK/TOPK在非小細胞肺癌中的表達與組織學類型、淋巴結轉移、遠處轉移及TNM分期有關（P值分別為0.027、0.000、0.000、0.000），而與其它臨床病理特征無明顯相關（P＞0.05）。
　　 免疫組化半定量分析結果顯示PBK/TOPK在正常肺組織、肺良性病

12、變及非小細胞肺癌原發(fā)灶及淋巴結轉移灶中的高表達率分別為:0％、0％、44.8％、75％，組內(nèi)比較差異具有非常的顯著性(P=0.000)。Kaplan-Meier單因素生存分析結果表明PBK/TOPK蛋白的表達、淋巴結轉移、TNM分期及遠處轉移與非小細胞肺癌患者的預后有關(P值均為0.000)。Cox比例風險回歸模型分析表明PBK/TOPK的表達、淋巴結轉移及TNM分期是影響非小細胞肺癌患者預后評價的因素(P值分別為0.000、0.009

13、、0.022)。
　　 2.PBK/TOPK與Ki-67及p53在非小細胞肺癌中表達的相關性及其預后意義分析
　　 在279例非小細胞肺癌原發(fā)灶組織中PBK/TOPK、Ki-67與p53的高表達率分別為44.8％、64.9％、49.1％。PBK/TOPK與Ki-67及p53的表達均具有正相關性（r=0.249，P=0.000; r=0.153，P=0.000）。
　　 在本研究中PBK/TOPK、Ki-67及p5

14、3蛋白高表達患者的5年生存率分別為:12.4％、18.2％、21.2％。單因素生存分析結果表明PBK/TOPK蛋白、Ki-67蛋白及p53蛋白的表達均與非小細胞肺癌患者的預后有關(P值分別為0.000、0.000、0.003)。PBK低/Ki-67低患者的術后中位生存期明顯高于PBK低/Ki-67高及PBK高/Ki-67高患者（P=0.029; P=0.000）;PBK低/p53低患者的術后中位生存期明顯高于PBK高/p53低及PBK高

15、/p53高患者（P=0.001; P=0.000）。Cox比例風險回歸模型的多因素分析表明PBK/TOPK、Ki-67及p53的表達均可作為影響非小細胞肺癌患者預后評估的因素(P值分別為0.000、0.015、0.034)。
　　 3.PBK/TOPK下調(diào)對非小細胞肺癌細胞遷移、增殖及存活能力的影響
　　 經(jīng)siRNA干擾后，GLC-82及A549細胞中的PBK/TOPKmRNA表達水平下調(diào)分別約83.6％、69.9％。

16、劃痕實驗及Transwell實驗結果表明PBK/TOPK下調(diào)可明顯抑制細胞的遷移。其中，在A549與GLC-82細胞的劃痕實驗中，干擾組細胞的遷移距離顯著低于對照組（P值分別為0.006、0.000）。在A549與GLC-82細胞的Transwell實驗中，干擾組的細胞遷移數(shù)量也明顯低于對照組(P值均為0.000)。
　　 MTT實驗結果表明PBK/TOPK下調(diào)可抑制細胞的增殖。在A549與GLC-82細胞中，干擾組細胞的增殖能

17、力明顯低于對照組，干擾48小時后差異較為明顯（P值均為0.000）。
　　 臺盼藍染色結果表明PBK/TOPK下調(diào)可降低細胞的存活能力。在A549與GLC-82細胞中，干擾組與對照組相比，PBK/TOPK下調(diào)后細胞的存活率均明顯降低（P值分別為0.002、0.005）。
　　 4.PBK/TOPK在非小細胞肺癌細胞中的表達與Ki-67及p53的關系
　　 經(jīng)QRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)PBK/TOPK mRNA在A54

18、9、GLC-82、H358及H460四株肺癌細胞中均有表達，其中在H358及GLC-82細胞中表達較高，在A549及H460細胞中表達較低。Western blot及細胞滴片免疫組化檢測結果均表明PBK/TOPK蛋白在H358及GLC-82細胞中表達較高，在A549及H460細胞中表達較低。PBK/TOPK蛋白在四種細胞中表達的PU值比較，差異具有顯著性(P=0.000)。
　　 經(jīng)QRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)突變型p53mRNA在A

19、549、GLC-82、H358及H460四種肺癌細胞中均有表達，其中在H358、H460及A549細胞中表達較高，在GLC-82細胞中表達較低;Western blot及細胞免疫組化檢測結果表明p53蛋白在H358、H460及A549細胞中表達較高，在GLC-82細胞中表達較低。p53蛋白在四種細胞中表達的PU值比較，差異具有非常的顯著性(P=0.000)。
　　 細胞滴片免疫組化檢測Ki-67蛋白在四種肺癌細胞中的表達，結果表

20、明Ki-67在四種細胞中均呈高表達，PU值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 將高表達PBK/TOPK的A549及GLC-82細胞分別經(jīng)siRNA干擾，PBK/TOPK表達明顯下調(diào)，A549和GLC-82細胞中PBK/TOPK mRNA下調(diào)分別為69.9％、83.6％，檢測突變型p53mRNA的表達，發(fā)現(xiàn)PBK/TOPK下調(diào)可促使其下調(diào)，其中在A549和GLC-82細胞中p53mRNA表達下調(diào)分別為74.5％、68.

21、5％，p53蛋白表達水平也下調(diào)。細胞滴片免疫組化檢測表明PBK/TOPK下調(diào)后A549和GLC-82細胞中Ki-67蛋白表達水平也出現(xiàn)了明顯下調(diào)，與對照組相比，PU值明顯減小（P值均為0.000）。
　　 結論:
　　 1.PBK/TOPK的表達與非小細胞肺癌的形成及轉移有關;PBK/TOPK在非小細胞肺癌中的表達與組織學類型、淋巴結轉移、遠處轉移及TNM分期有關，其表達可作為影響非小細胞肺癌患者預后評估的要素。

22、　　 2.PBK/TOPK與Ki-67及p53在非小細胞肺癌中的表達均呈正相關性，PBK高/Ki-67高及PBK高/p53高的患者預后較差。
　　 3.Ki-67及p53的高表達與非小細胞肺癌患者預后不良相關，均可作為影響非小細胞肺癌患者預后評估的要素。
　　 4.PBK/TOPK具有促進非小細胞肺癌細胞遷移、增殖及存活的能力。
　　 5.PBK/TOPK在非小細胞肺癌中的作用機制與Ki-67及p53密切相關。