鼻咽癌超微結(jié)構(gòu)及Ki-67、p53表達(dá)的定量分析與診斷預(yù)后的關(guān)系.pdf

1、鼻咽癌(nasophatyngeal carcinoma,NPC)是我國華南地區(qū)常見惡性腫瘤之一。廣東、廣西、湖南、福建等南方各地發(fā)病率較高,占鼻咽部惡性腫瘤的92％(1)。NPC的病理類型:(1).非角化性癌(未分化型,分化型,混合型)；(2)角化性鱗狀細(xì)胞癌。NPC早期診斷較難。體視學(xué)理論與圖像分析技術(shù)面向醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用是目前國內(nèi)外從事生物醫(yī)學(xué)圖像分析專家及病理學(xué)醫(yī)生積極探索解決、希望能有所突破的問題之一。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)NPC細(xì)胞株、N

2、PC組織、鼻咽部正常粘膜上皮、鼻咽部慢性炎癥粘膜上皮的超微結(jié)構(gòu)研究,力求揭示NPC細(xì)胞體視學(xué)超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、對(duì)NPC細(xì)胞進(jìn)行量化診斷。
　　 Ki-67是發(fā)生在增殖細(xì)胞中表達(dá)的一種核抗原,Ki67的表達(dá)局限于細(xì)胞周期的G1期到M期,參與細(xì)胞有絲分裂,其陽性表達(dá)高低與細(xì)胞增殖活性密切相關(guān)。廣泛應(yīng)用于評(píng)估腫瘤細(xì)胞的增值活性,因此可作為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)、評(píng)估腫瘤的預(yù)后和判斷惡性腫瘤遠(yuǎn)隔臟器轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)性的重要指標(biāo)。關(guān)于Ki67的表達(dá)與腫瘤預(yù)

3、后的關(guān)系研究較多,多數(shù)研究提示Ki67的表達(dá)與腫瘤分化程度呈正相關(guān),而與腫瘤的臨床分期、是否伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、瘤體大小的關(guān)系在不同類型腫瘤中的研究結(jié)果不盡相同。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為Ki-67表達(dá)的高低與腫瘤的組織類型、分化程度及預(yù)后有關(guān)。目前國內(nèi)有關(guān)Ki-67與NPC的文獻(xiàn)報(bào)道較少。
　　 P53基因是一種廣譜的抑癌基因,p53基因通過其產(chǎn)物p53蛋白實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控。P53蛋白只在人鼻咽癌組織中和癌旁不典型增生的上皮有表達(dá),而在鼻咽

4、正常組織中無表達(dá)。提示p53蛋白的過表達(dá)可能與人鼻咽癌的發(fā)生有密切的關(guān)系,p53蛋白陽性可作為鼻咽癌診斷的參考指標(biāo)。國內(nèi)外有關(guān)p53蛋白在結(jié)腸癌、直腸癌、乳腺癌、肺癌中表達(dá)的研究較多,p53蛋白在各種腫瘤的表達(dá)情況有所差別。以上文獻(xiàn)報(bào)道均采用半定量的方法。
　　 目的和意義
　　 1.探討NPC細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特征,為臨床診斷NPC提供臨床病理學(xué)診斷依據(jù)。
　　 2.定量分析Ki-67、p53蛋白在iNPC組織中的

5、表達(dá),從量化角度揭示其在NPC組織中表達(dá)的病理學(xué)意義。
　　 3.觀察Ki-67、p53蛋白在NPC中的表達(dá),從定量和半定量兩方面探討Ki-67、p53蛋白與NPC預(yù)后的關(guān)系,為臨床分析NPC預(yù)后提供一定的病理學(xué)依據(jù)。
　　 材料和方法
　　 一.鼻咽癌超微結(jié)構(gòu)分析
　　 實(shí)驗(yàn)材料:病例來自我校南方醫(yī)院和珠江醫(yī)院門診及三九腦科醫(yī)院門診,所選標(biāo)本是耳鼻喉科門診鼻咽癌診室醫(yī)生鉗取(鼻咽鏡下)的新鮮鼻咽癌組織,

6、共取疑似鼻咽癌最后病理論斷為慢性炎癥患者的炎性上皮12例,20例鼻咽癌患者的正常鼻咽上皮、鼻咽癌組織,共計(jì)52例標(biāo)本。癌組織經(jīng)病理確診為非角化性鼻咽癌14例和角化性鱗狀細(xì)胞癌6例(包括高分化鱗癌、低分化鱗癌)。納入病例要求被取活檢的鼻咽癌患者均未經(jīng)任何抗腫瘤治療(放、化療),且為臨床首次被確診的鼻咽癌患者。鼻咽癌細(xì)胞株(5-8F和CNE-1)為南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所保存細(xì)胞系。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:新鮮標(biāo)本采集后,離體后一分鐘內(nèi)切成

7、大小為1～2mm3組織塊三到五塊,取材的刀片要鋒利,低溫操作,通常為4℃,1min內(nèi)入2.5％戊二醛電鏡固定液前固定,4℃固定2～4h,漂洗；后固定1.5～2h,漂洗；脫水；置換；浸透；包埋；在解剖顯微鏡下修塊；半薄切片；HE染色；在解剖顯微鏡下和普通顯微鏡下定位；超薄切片；電子染色；干燥后電鏡觀察。攝片后測(cè)試細(xì)胞核的周長(Cn)、面積(An)、體積(v11)、體積密度(Vvn)、數(shù)密度(Nvn)、表面積密度(Svn),細(xì)胞的周長(Cc

8、)、面積(Ac)共8個(gè)結(jié)構(gòu)參數(shù)
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS 13.0軟件,對(duì)正常鼻咽上皮、鼻咽部慢性炎癥上皮、鼻咽癌組織以及鼻咽癌細(xì)胞株(5-8F和CNE-1)的細(xì)胞和細(xì)胞核所測(cè)得的結(jié)構(gòu)參數(shù)值進(jìn)行單因素方差分析、組間的兩兩比較分析(L SD法)以及兩組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。
　　 二.Ki-67和p53在鼻咽癌中的定量表達(dá)及其與診斷預(yù)后的關(guān)系
　　 實(shí)驗(yàn)材料和分組:收集南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院病理科2000年

9、1月至2005年12月經(jīng)常規(guī)HE切片后確診為鼻咽癌(NPC)的活檢標(biāo)本79例,平均年齡47.00±11.72(14～70歲)；其中男性63例,平均年齡47.24±12.23(14～70歲)；女性18例,平均年齡46.12±9.89(27～67歲)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的37例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的42例:有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的24例,無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的55例；TNM分期Ⅰ期～Ⅱ期20例,Ⅲ期34例,Ⅳ期25例。以上病例均有較完整的臨床資料和5年以上的隨訪結(jié)果,并且均

10、為首診、未經(jīng)任何治療的鼻咽癌患者標(biāo)本?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn):1.納入標(biāo)準(zhǔn):本院附屬醫(yī)院病理科2000-2005經(jīng)病理活檢確診為鱗狀細(xì)胞癌；2.首次就診；3.治療前活檢標(biāo)本完好；4.隨訪5年以上；5.病歷資料完整。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)Ki-67和p53蛋白在鼻咽癌中的表達(dá)情況,用Leica Q500 MC圖像分析系統(tǒng)測(cè)試Ki-67和p53蛋白的陽性單位(PU)值,定量分析Ki-67和p53在鼻咽癌中的表達(dá)及基于量化改

11、變的變化規(guī)律,分析其與臨床特征和生存時(shí)間的關(guān)系。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理。各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間多重比較采用LSD法。以P<0.05表示差異具有顯著性。應(yīng)用Spearman法分析Ki-67、p53陽性細(xì)胞率與鼻咽癌患者生存時(shí)間之間的關(guān)系。采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析,顯著性檢驗(yàn)采用Log rank法,

12、對(duì)預(yù)后因素采用COX回歸分析。
　　 結(jié)論
　　 1.鼻咽癌細(xì)胞與鼻咽正常上皮、炎性病變上皮細(xì)胞的定量測(cè)試結(jié)果表明,鼻咽癌細(xì)胞及核的結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的改變,其病理發(fā)展過程存在一個(gè)由正常鼻咽上皮→異型增生→癌變的漸進(jìn)過程；因此在鼻咽癌的診斷分析中,可以用鼻咽癌細(xì)胞及核的結(jié)構(gòu)參數(shù)值對(duì)鼻咽正常上皮細(xì)胞、異型增生上皮細(xì)胞及癌細(xì)胞進(jìn)行判別分析。
　　 2.Ki-67蛋白表達(dá)程度與NPC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、患者生存時(shí)間及TNM分期相關(guān)；K

13、i67陽性細(xì)胞率與患者生存時(shí)間相關(guān)。臨床分期高、伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、生存期短的患者其Ki-67蛋白PU值大,Ki-67蛋白表達(dá)強(qiáng).Ki-67細(xì)胞陽性率越高,NPC患者生存時(shí)間越短；Cox回歸模型(Cox regression)多因素生存分析顯示:Ki67陽性細(xì)胞率是影響鼻咽癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素(BE=5.67、P=0.034)。結(jié)果表明,Ki67陽性細(xì)胞率每增加十個(gè)百分點(diǎn),鼻咽癌患者的死亡率就增加5.67倍。
　　 3.p53蛋白