多囊卵巢綜合征源性人胚胎干細胞建系、鑒定及意義.pdf

1、胚胎干細胞（embryonicstemcells，ESCs）是由囊胚內細胞團（innercellmass，ICM）或原始生殖細胞（primordialgermcells，PGCs）經體外抑制分化培養(yǎng)后，分離出的具有發(fā)育全能性的細胞。ESCs可保持未分化狀態(tài)在體外無限傳代培養(yǎng)，并保持正常的細胞核型，在適當的環(huán)境中可以分化成三個胚層來源的任何類型細胞，包括體細胞和生殖細胞。人胚胎干細胞（humanembryonicstemcells，hES

2、Cs）不僅能定向誘導分化成人體體細胞，用于細胞或組織器官移植，而且在研究物種發(fā)育機制，闡明基因功能，篩選藥物，遺傳性疾病的基因治療等方面具有廣闊的前景。為使hESCs能夠應用于各種疾病的臨床治療，學者對其進行了大量研究并取得一定進展，如維持hESCs全能性、無限增殖及自我更新相關基因的發(fā)現，體外誘導hESCs分化為胰島細胞、神經細胞、造血細胞、心肌細胞等培養(yǎng)模式的初步建立等。另外，hESCs在遺傳性疾病治療方面具有重要的研究前景，建立攜

3、帶遺傳性疾病基因的人胚胎干細胞系是進行發(fā)育早期遺傳性疾病的發(fā)病機理、遺傳疾病基因定位及基因治療等研究的基礎。
　　 多囊卵巢綜合征（polycysticovarysyndrome，PCOS）是育齡婦女最常見的復雜的內分泌失調性疾病，迄今為止，發(fā)病機制尚不清楚，無有效的治療措施。目前認為其病變可能起始于胚胎期，家族聚集現象提示可能與遺傳因素有關。國內外已利用胚胎植入前遺傳學診斷技術（preimplantationgeneticdi

4、agnosis，PGD）或核移植技術建立攜帶有先天性或者“轉基因”的遺傳性ES細胞系，但尚無關于PCOS源性人胚胎干細胞建系的報道。
　　 第一部分：
　　 1本實驗利用本中心PCOS患者體外受精-胚胎移植（invitrofertilization-embryotransfer，IVF-ET）周期中，不適合移植和冷凍的新鮮廢棄胚胎，或廢棄的冷凍胚胎建立PCOS源性人胚胎干細胞系，為研究PCOS患者的19枚冷凍胚胎，解凍后

5、存活14枚胚胎，復蘇率為73.7％，序貫培養(yǎng)后形成6枚囊胚，囊胚形成率為42.9％，優(yōu)質囊胚2枚，優(yōu)質囊胚率為33.3％，A級ICM有1枚，B級ICM有1枚，C級ICM有4枚。機械分離法獲得5枚ICM。
　　 2.PCOS源性hESCs的建立共接種16枚ICM到混合飼養(yǎng)層上，48h內貼壁13個，貼壁率為81.3％，貼壁的ICM均能長出原代克隆。利用新鮮廢棄胚胎共建立5株PCOS源性的人胚胎干細胞系，分別命名為p-hES-1，p-

6、hES-2，p-hES-3，p-hES-4，p-hFS-5。p-hES-1傳至36代后將所有細胞采用玻璃化冷凍方法凍存，目前p-hES-2傳至32代，p-hES-3傳至28代，p-hES-4傳至25代，p-hES-5傳至19代，仍在體外繼續(xù)培養(yǎng)。解凍胚胎來源的克隆目前有5個，傳至3-4代，繼續(xù)培養(yǎng)中。
　　 3.PCOS源性hESCs的鑒定結果3.1倒置顯微鏡下觀察，hESCs呈鳥巢狀，細胞界限清楚。
　　 3.25株h

7、ESCs細胞內堿性磷酸酶活性較強，克隆染成紫藍色；免疫熒光法檢測細胞表面抗原SSEA-4表達呈陽性。
　　 3.35株hESCs細胞內均表達OCT-4。
　　 3.45株hESCs體外懸滴培養(yǎng)后可自發(fā)分化形成擬胚體。
　　 3.55株hESCs的細胞懸液注射入SCID小鼠體內可形成畸胎瘤，HE染色切片可見腺體、肌肉組織、脂肪細胞、骨組織等結構。
　　 3.65株hESCs核型均正常，分別為46，XY：46

8、，XX；46，XX；46，XY；46，XX。
　　 結論：
　　 1.新鮮廢棄胚胎有不同程度的發(fā)育潛能，若能合理利用新鮮廢棄胚胎，以及已成功妊娠、順利分娩患者的廢棄冷凍胚胎，可有效地緩解hESCs建系過程中胚胎缺乏的問題，并減少其中的倫理學紛爭。
　　 2.本研究首次報道了5株PCOS源性人胚胎干細胞系的建立，均符合目前hESCs的鑒定標準，能夠在體內、體外向三個胚層細胞分化。
　　 3.PCOS源性人胚

9、胎干細胞系的建立可為研究PCOS的發(fā)病機理、篩選候選基因、基因定位及基因治療等方面提供了一個良好的生物學模型。
　　 第二部分：
　　 1內細胞團位PCOS患者的19枚冷凍胚胎，解凍后存活14枚胚胎，復蘇率為73.7％，序貫培養(yǎng)后形成6枚囊胚，囊胚形成率為42.9％，優(yōu)質囊胚2枚，優(yōu)質囊胚率為33.3％，A級ICM有1枚，B級ICM有1枚，C級ICM有4枚。機械分離法獲得5枚ICM。
　　 2.PCOS源性hES

10、Cs的建立共接種16枚ICM到混合飼養(yǎng)層上，48h內貼壁13個，貼壁率為81.3％，貼壁的ICM均能長出原代克隆。利用新鮮廢棄胚胎共建立5株PCOS源性的人胚胎干細胞系，分別命名為p-hES-1，p-hES-2，p-hES-3，p-hES-4，p-hES-5。p-hES-1傳至36代后將所有細胞采用玻璃化冷凍方法凍存，目前p-hES-2傳至32代，p-hES-3傳至28代，p-hES-4傳至25代，p-hES-5傳至19代，仍在體外繼續(xù)

11、培養(yǎng)。解凍胚胎來源的克隆目前有5個，傳至3-4代，繼續(xù)培養(yǎng)中。
　　 3.PCOS源性hESCs的鑒定結果3.1倒置顯微鏡下觀察，hESCs呈鳥巢狀，細胞界限清楚。
　　 3.25株hESCs細胞內堿性磷酸酶活性較強，克隆染成紫藍色；免疫熒光法檢測細胞表面抗原SSEA-4表達呈陽性。
　　 3.35株hESCs細胞內均表達OCT-4。
　　 3.45株hESCs體外懸滴培養(yǎng)后可自發(fā)分化形成擬胚體。

12、　　 3.55株hESCs的細胞懸液注射入SCID小鼠體內可形成畸胎瘤，HE染色切片可見腺體、肌肉組織、脂肪細胞、骨組織等結構。
　　 3.65株hESCs核型均正常，分別為46，XY；46，XX；46，XX；46，XY；46，XX。
　　 結論：
　　 1.新鮮廢棄胚胎有不同程度的發(fā)育潛能，若能合理利用新鮮廢棄胚胎，以及已成功妊娠、順利分娩患者的廢棄冷凍胚胎，可有效地緩解hESCs建系過程中胚胎缺乏的問題，并