大鼠單倍體胚胎干細胞建系及功能研究.pdf

1、大鼠是最早被應用于科學研究的哺乳類模式動物。雖然小鼠作為模式動物廣泛應用于科學研究，但和小鼠相比，大鼠體現(xiàn)出了很多優(yōu)勢，比如大鼠體型比小鼠大很多，便于進行各種外科手術，并且與小鼠相比在生理調節(jié)和藥理反應等方面與人類的更相近，因此大鼠已經(jīng)被廣泛地應用于生理學、免疫學、移植醫(yī)學、神經(jīng)科學、癌癥學、遺傳學和老化等領域。1981年第一株小鼠胚胎干細胞系被成功建立，其能夠在體外無限擴增，且具有發(fā)育的多能性，因此在基因功能研究、基因修飾以及細胞治療

2、和臨床等方面都有廣闊的應用前景。第一只克隆小鼠由日本科學家Wakayama首次成功完成，雖然之后大鼠克隆也由周琪通過調整卵母細胞激活周期而完成，但一直以來大鼠胚胎干細胞沒有被成功建立，因此在構建基因敲除動物模型領域，大鼠的研究遠遠落后于小鼠。2008年，華人科學家應其龍等利用無血清培養(yǎng)體系，即基礎培養(yǎng)液N2B27添加GSK3及ERK/MEK信號通路的抑制因子(2i: CHIR99021，PD0325901)及大鼠Lif，首次建立了具有種

3、系嵌合能力的真正的大鼠胚胎干細胞系，從而解決了限制大鼠轉基因模型研究的瓶頸。但是相比較于小鼠，獲得轉基因大鼠以及基因敲除大鼠仍然花費更大，這嚴重影響了大鼠模型在生物研究及醫(yī)療領域的應用。
　　2010年，研究人員建立了斑馬魚的單倍體胚胎干細胞系，這些單倍體干細胞只有一套染色體，因此通過正反向遺傳篩選技術能夠快速地分析哺乳動物發(fā)育和一些性狀基因調控網(wǎng)絡，還可以建立產(chǎn)生純合子基因突變文庫作為發(fā)現(xiàn)基因-性狀的資源。2011年，第一株哺乳

4、動物孤雌單倍體胚胎干細胞被建立，使得哺乳動物單倍體胚胎干細胞成為了年度研究的熱點。2012年，周琪研究組和李勁松研究組同時建立了孤雄單倍體胚胎干細胞系，證明了這些細胞仍然具有雄性配子功能——這些細胞能夠代替精子，注入卵母細胞后可以產(chǎn)生健康的小鼠。
　　本研究探索了獲得單倍體孤雄及孤雌胚胎的“精子克隆法”和“受精卵去原核法”兩種方法，比較了單倍體胚胎體內和體外的發(fā)育效率，獲得了大鼠單倍體囊胚繼而在優(yōu)化后的5％knock-outser

5、umreplacement的N2B27并添加抑制因子PD0325901，CHIR99021，A8301，Y27632以及Lif的培養(yǎng)體系中完成了大鼠孤雄及孤雌單倍體胚胎干細胞的建系。
　　從克隆形態(tài)上看，大鼠單倍體胚胎細胞系具有典型的大鼠胚胎干細胞形態(tài)，呈克隆狀，貼壁或懸浮生長。通過流式細胞分選技術對大鼠單倍體胚胎細胞系根據(jù)DNA含量進行分選，通過數(shù)次分選可以將單倍體細胞富集。大鼠單倍體胚胎細胞系具有大鼠單倍體（21條）核型，體外

6、培養(yǎng)超過30代的大鼠單倍體胚胎細胞系進行aCGH實驗后發(fā)現(xiàn)，體外經(jīng)過反復傳代后的大鼠單倍體胚胎干細胞系具有完整的大鼠單倍基因組，并且沒有明顯的拷貝數(shù)變異。從多能性角度分析，大鼠單倍體胚胎細胞系具有較高的多能性水平，主要體現(xiàn)在:堿性磷酸酶染色結果呈陽性;經(jīng)RT-PCR，免疫熒光染色和western blot等方法檢測，我們所建立的大鼠單倍體胚胎干細胞系表達Oct4，Nanog，Sox2和SSEA-1等細胞多能性marker;能夠維持自我更

7、新且具有無限傳代能力;在隨機分化條件下可以在體外分化成擬胚體（Embryoid bodys，EBs）;體內囊胚嵌合實驗可以得到高比例嵌合的二倍體嵌合體大鼠，且大部分嵌合體大鼠可以存活至成年，將獲得的雌性嵌合體大鼠與SD品系雄性大鼠交配后能夠得到種系嵌合的子代大鼠，這首次證明了單X染色體的單倍體孤雄胚胎干細胞具有種系傳遞能力;利用大鼠單倍體胚胎干細胞的單倍性以及其可自我更新和復制的干細胞特點用PB轉座酶系統(tǒng)進行隨機位點插入和基因捕獲操作獲