我國(guó)長(zhǎng)期抗病毒治療失敗艾滋病患者基因型耐藥和表型耐藥研究.pdf

1、目的：
　　艾滋病是威脅人類健康的重大傳染性疾病，據(jù)估計(jì)中國(guó)已有艾滋病病毒感染者和艾滋病患者74萬(wàn)，其中艾滋病患者10.5萬(wàn)，艾滋病流行和防治形勢(shì)依然嚴(yán)峻。艾滋病尚無(wú)治愈方法，高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（Highly Active AntiretroviralTherapy, HAART）是目前最有效治療艾滋病并控制HIV傳播的方法。然而，隨著HAART的廣泛應(yīng)用，新的耐藥變異在不斷出現(xiàn)，HIV耐藥日趨嚴(yán)重，已成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生熱點(diǎn)

2、問(wèn)題。
　　南非、烏干達(dá)及巴西等地的研究發(fā)現(xiàn)， HAART治療病毒學(xué)失敗的HIV-1感染者出現(xiàn)耐藥突變的比例在86％以上，耐藥突變位點(diǎn)隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增多。我國(guó)在2002年啟動(dòng)了艾滋病免費(fèi)抗病毒治療，隨著我國(guó)免費(fèi)抗病毒治療的推廣，全國(guó)接受抗病毒治療的艾滋病人累計(jì)已接近10萬(wàn)人，隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)，耐藥率也在逐年增加，但目前報(bào)道的多為治療時(shí)間在2-3年內(nèi)的耐藥研究，對(duì)于治療時(shí)間3年以上的治療失敗患者的耐藥情況尚無(wú)報(bào)道。在我國(guó)長(zhǎng)期

3、服用一線抗病毒治療方案的艾滋病人治療失敗后，耐藥突變率是否仍持續(xù)上升？與治療時(shí)間短的患者相比較是否出現(xiàn)更多的耐藥突變位點(diǎn)？更多耐藥位點(diǎn)的出現(xiàn)能否用現(xiàn)有的耐藥數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)進(jìn)行解釋？這些問(wèn)題都尚無(wú)報(bào)道。
　　HIV-1耐藥性檢測(cè)方法主要有基因型檢測(cè)和表型檢測(cè)兩種。基因型檢測(cè)是目前全球普遍采用的方法，它通過(guò)擴(kuò)增病毒的耐藥相關(guān)基因序列后提交到斯坦福HIV耐藥數(shù)據(jù)庫(kù)判斷病毒的耐藥性。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、快速、費(fèi)用低，缺點(diǎn)是僅是一種間接、定性

4、判斷耐藥性的方法，是利用耐藥數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)耐藥表型的一種預(yù)測(cè)。表型耐藥檢測(cè)通過(guò)測(cè)定不同藥物濃度下病毒的復(fù)制能力來(lái)檢測(cè)病毒對(duì)藥物的敏感性，能定量進(jìn)行藥物敏感性判斷，是對(duì)病毒耐藥性進(jìn)行分析的標(biāo)準(zhǔn)方法。該方法檢測(cè)的是不同耐藥突變相互作用的凈效應(yīng)，能夠直接判斷毒株的耐藥性，可以彌補(bǔ)基因型耐藥檢測(cè)的不足，提供更為可靠的耐藥信息?；蛐湍退幣c表型耐藥檢測(cè)結(jié)果不一致時(shí)，國(guó)際上通常以表型耐藥檢測(cè)結(jié)果為準(zhǔn)。以往都用活病毒進(jìn)行表型耐藥檢測(cè)，由于活病毒表型耐藥檢測(cè)

5、耗時(shí)、費(fèi)力、實(shí)驗(yàn)室條件要求過(guò)高，目前國(guó)外正在開(kāi)發(fā)假病毒表型耐藥檢測(cè)方法，已逐漸發(fā)展成為國(guó)際普遍采用的表型耐藥檢測(cè)方法，國(guó)內(nèi)尚無(wú)應(yīng)用假病毒對(duì)HAART治療失敗人群進(jìn)行表型耐藥的研究報(bào)道。
　　綜上所述，本研究選取長(zhǎng)期服用一線抗病毒治療方案后病毒學(xué)失敗的患者，進(jìn)行基因型耐藥檢測(cè)，明確該人群耐藥變異情況;建立假病毒表型耐藥檢測(cè)方法，對(duì)上述病例進(jìn)行假病毒表型耐藥檢測(cè)，與基因型耐藥檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析;進(jìn)一步應(yīng)用活病毒表型耐藥檢測(cè)方法驗(yàn)證假

6、病毒表型耐藥方法的有效性，以期尋找適合長(zhǎng)期抗病毒治療后病毒學(xué)失敗患者的耐藥檢測(cè)方法。
　　方法：
　　1、研究對(duì)象
　　研究對(duì)象入選標(biāo)準(zhǔn):接受HAART治療3年以上，并根據(jù)《艾滋病診療指南》中病毒學(xué)失敗的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)符合下列任一條件者即符合入選標(biāo)準(zhǔn):
　　(1)經(jīng)HAART后血漿中病毒載量沒(méi)有降至“測(cè)不出(＜400copies/ml)”的水平;
　　(2)血漿中病毒載量經(jīng)HAART治療已達(dá)到“測(cè)不出(＜400

7、copies/ml)”的水平后又出現(xiàn)明顯反跳;
　　選取河南及遼寧地區(qū)27名長(zhǎng)期治療失敗病例，按照知情同意的原則，以統(tǒng)一的問(wèn)卷逐一進(jìn)行咨詢?cè)L談，在采集流行病學(xué)資料的同時(shí)對(duì)病人進(jìn)行臨床體檢并以EDTA-3K抗凝管采集HIV-1感染者外周靜脈血?？鼓?4小時(shí)內(nèi)測(cè)定CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)，全血經(jīng)常規(guī)離心分離血漿，分裝后-80℃凍存用于病毒載量和基因型耐藥的測(cè)定。
　　經(jīng)構(gòu)建進(jìn)化樹分析，2例取自遼寧的B'亞型與河南的B'亞型遺傳距

8、離接近，且存在多個(gè)耐藥突變位點(diǎn)，其表型耐藥檢測(cè)結(jié)果可適用于河南B'亞型病例的表型耐藥分析。
　　2、CD4+T細(xì)胞絕對(duì)值的檢測(cè)
　　應(yīng)用美國(guó)BD公司的流式細(xì)胞儀(FACS CALIBUR)測(cè)定CD4+、CD8+、CD3+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值。將20μl CD4/CD8/CD3 TRITEST試劑加入CD4絕對(duì)計(jì)數(shù)管，加入50μl抗凝血，室溫避光15min，加入免洗溶血素450μl，室溫避光15min，F(xiàn)ACSMULTISET軟件

9、檢測(cè)并進(jìn)行自動(dòng)分析。
　　3、病毒載量測(cè)定
　　以200μl血漿采用標(biāo)準(zhǔn)版模板制備法提取RNA，采用Roche公司HIV-1Monitor(1).5 commercial kit在COBASAMPLICOR自動(dòng)載量?jī)x上以RT-PCR方法測(cè)定病毒載量。檢測(cè)范圍為400-750000copies/ml。
　　4、病毒核酸提取
　　以140μl血漿提取病毒基因組RNA，按照QIAamp Viral RNA Mini K

10、it說(shuō)明書步驟提取RNA，提取物溶于60μl洗脫液中。
　　5、耐藥株基因變異的測(cè)定
　　RNA逆轉(zhuǎn)錄PCR和套式PCR方法，以外側(cè)引物對(duì):yp-1(5'-GCAAGAGTTTTGGCTGAAGCAATGAG-3' HIV-1 HXB21867-1892nt)和yp-2(5'-CCTTGCCCCTGCTTCTGTATTTCTGC-3' HIV-1HXB23528-3553nt);內(nèi)側(cè)引物對(duì):yp-3(5'-TGCAGGGCC

11、CCTAGGAAAAAGGGCTG-3' HIV-1HXB22002-2027nt)和yp-4(5'-CATGTACCGGTTCTTTTAGAATCTCTCTGTT-3' HIV-1 HXB23465-3495nt)用于擴(kuò)增HIV-1蛋白酶1-99氨基酸和逆轉(zhuǎn)錄酶1-240氨基酸的編碼區(qū)序列。
　　6、PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化
　　取終產(chǎn)物5μl進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠成像后與marker比對(duì)，確認(rèn)所需片段，用QIAquic

12、k Gel Extraction Kit試劑盒純化基因片段。
　　7、病毒分離
　　感染者PBMC用Ficoll-Hypaque密度梯度分層液分離，并與至少兩個(gè)正常人的經(jīng)植物凝集素(PHA)(5μg/ml)刺激2-3天的PBMC共培養(yǎng)法復(fù)制病毒。每3-4天換液1次，每7天添加1次經(jīng)PHA刺激生長(zhǎng)3天的正常人PBMC。定期對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞上清中的病毒p24抗原含量進(jìn)行檢測(cè)，按照說(shuō)明書操作，對(duì)檢測(cè)陽(yáng)性的病毒進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。所分離的病毒凍

13、存于液氮中備用。
　　8、TA克隆
　　擴(kuò)增的pol基因1494bp片段插入克隆載體pMD-18載體，轉(zhuǎn)入化學(xué)感受態(tài)菌DH5α擴(kuò)大培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙脫氧終止法測(cè)序。
　　9、帶有患者POL基因片段的嵌合質(zhì)粒構(gòu)建
　　取含患者來(lái)源的pol基因片段的TA克隆質(zhì)粒，進(jìn)行ApaⅠ/AgeⅠ雙酶切，同樣將pNL4-3-dE-EGFP質(zhì)粒經(jīng)雙酶切獲得缺失gag-pol區(qū)段目標(biāo)片段的空載體。用T4DNA連接酶連接酶

14、切產(chǎn)物，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α、涂板和挑選克隆增菌實(shí)驗(yàn)，從增菌液中提取重組質(zhì)粒DNA，并進(jìn)行測(cè)序鑒定。
　　10、功能性假病毒的獲得
　　將帶有病人HIV-1 pol基因片段的重組質(zhì)粒pNL4-3-dE-GFP和pVSV-G質(zhì)粒通過(guò)Fugene HD轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，37℃培養(yǎng)48小時(shí)，吸出細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清，經(jīng)0.45μm濾器過(guò)濾去掉細(xì)胞碎片即獲得假病毒。
　　11、假病毒及活病毒耐藥性檢測(cè)
　　

15、將梯度稀釋的藥物在假病毒或真病毒感染受體細(xì)胞TZM-bl時(shí)加入到培養(yǎng)液中，干擾病毒的感染過(guò)程。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，利用熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定每孔的熒光信號(hào)值以檢測(cè)耐藥表型。
　　12、耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)和耐藥數(shù)據(jù)分析:
　　基因型耐藥判定標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)斯坦福耐藥網(wǎng)站評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行基因型耐藥藥物耐受程度評(píng)估，0-9分:敏感(S);10-14分:潛在耐藥(P);15-29分:低度耐藥(L);30-59分:中度耐藥(I);＞60分，高度耐藥(H

16、)。
　　表型耐藥判定標(biāo)準(zhǔn):臨床病毒IC50與野生株IC50相比，根據(jù)倍數(shù)變化(FoldChange，F(xiàn)C)判斷臨床病毒耐藥水平。根據(jù)IC50倍數(shù)變化將病毒耐藥水平分為敏感(S∶ FC＜4倍)和耐藥(R)兩類，耐藥又分為中度耐藥(I∶FC4-10倍)和高度耐藥(H∶FC＞10倍)。
　　所有藥物濃度均轉(zhuǎn)化為log10濃度值，每一濃度樣品孔均計(jì)算平均RLU值，計(jì)算每一濃度樣品熒光抑制率，計(jì)算公式:
　　藥物抑制率(％)=

17、[1-（加藥孔發(fā)光值-細(xì)胞對(duì)照孔發(fā)光值）/（病毒對(duì)照孔發(fā)光值-細(xì)胞對(duì)照孔發(fā)光值）]×100％。
　　數(shù)據(jù)分析利用Graphpad Prism V5.0軟件，采用非線性回歸分析中四參數(shù)S型劑量方程分析每種藥物的IC50值。
　　13、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:
　　所有資料采用SPSS11.5軟件分析，數(shù)據(jù)處理成均值±標(biāo)準(zhǔn)差。統(tǒng)計(jì)概率采用四格表精確概率檢驗(yàn)，p＜0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　一、長(zhǎng)期抗病毒治療失

18、敗人群基因型耐藥研究結(jié)果
　　1、研究對(duì)象的人口學(xué)、病毒學(xué)和免疫學(xué)特征:
　　27例治療失敗病例中男性16例，占59.3％，女性11例，占40.7％;平均年齡44±7歲。研究對(duì)象全部為漢族。HIV-1均為B'亞型。至檢測(cè)時(shí)，平均服藥時(shí)間為60±10月。27例患者的CD4計(jì)數(shù)為241±155個(gè)/μl，病毒載量為4.4±0.8 log10copies/ml。
　　2、耐藥相關(guān)位點(diǎn):
　　27例患者100％檢測(cè)出NNR

19、TI耐藥相關(guān)突變，突變位點(diǎn)及頻率分別為K103N(40.7％,11/27)、Y181C(25.9％,7/27)、G190A(22.2％,6/27)、K101E、 K238T(11.1％，3/27)和Y188L(7.4％，2/27)。其中23例(85.2％，23/27)檢測(cè)出NRTI耐藥相關(guān)突變，突變位點(diǎn)為M41L(59.3％，16/27)、T215Y(44.4％，12/27)、L210W(40.7％,11/27)、K70R(33.3％,

20、9/27)、M184V(29.6％,8/27)、D67N(25.9％,7/27)以及L74V(22.2％，6/27)。與治療時(shí)間在3年以內(nèi)的患者相比，檢測(cè)到未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的K219N、V90I、V106I和H221C耐藥突變位點(diǎn)。27例患者均未檢出PI耐藥相關(guān)主要突變，其中11例(40.7％，11/27)檢測(cè)出PI耐藥相關(guān)次級(jí)突變，其中以A71T(81.8％，9/11)出現(xiàn)的頻率最高。
　　3、對(duì)抗病毒藥物的敏感性:
　　對(duì)N

21、NRTIs呈高水平耐藥，對(duì)NVP和EFV的耐藥率高達(dá)96.3％，對(duì)其他幾種納入免費(fèi)抗病毒治療的NRTIs耐藥率分別為:3TC:66.7％，AZT:77.8％, d4T:77.8％, ddI:81.5％。
　　二、假病毒表型耐藥研究結(jié)果
　　1、重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果:
　　27例病例均獲得重組質(zhì)粒。用重組質(zhì)粒與pVSV-G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，有16例獲得具有感染性的假病毒。對(duì)16例重組質(zhì)粒測(cè)序，有2例患者質(zhì)粒在逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)

22、測(cè)序結(jié)果與PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果略有差異，但提交斯坦福耐藥數(shù)據(jù)庫(kù)后耐藥預(yù)測(cè)無(wú)差異。對(duì)質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物與重組質(zhì)粒遺傳距離非常接近。
　　2、基因型耐藥檢測(cè)結(jié)果:
　　100％(16/16)患者對(duì)至少一種逆轉(zhuǎn)錄酶藥物耐藥，其中93.8％(15/16)對(duì)NNRTI耐藥，對(duì)NRTI的耐藥率分別為:3TC:56.3％，AZT:75.0％，d4T:75.0％,ddI:75.0％。
　　3、

23、用假病毒表型耐藥方法檢測(cè)結(jié)果:
　　100％(16/16)患者對(duì)至少一種逆轉(zhuǎn)錄酶藥物耐藥，其中87.5％(14/16)對(duì)NNRTI耐藥，對(duì)NRTI的耐藥率分別為:3TC:93.8％，AZT:68.8％，d4T:43.8％，ddI:56.2％。
　　4、表型耐藥檢測(cè)與基因型耐藥檢測(cè)的關(guān)系:
　　通過(guò)比較表型和基因型耐藥檢測(cè)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)于ddI、3TC、d4T、AZT和EFV五種藥物，分別有50％(8/16)、37.5

24、％(6/16)、31.3％(5/16)、18.8％(3/16)和18.8％(3/16)的基因型和表型耐藥結(jié)果不一致。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)于3TC，6例均為基因型敏感而表型耐藥。對(duì)于d4T，5例均為基因型耐藥而表型敏感。對(duì)于AZT和EFV，分別有2例為基因型耐藥而表型敏感，另有1例為基因型敏感而表型耐藥。對(duì)于ddI，有5例為基因型耐藥而表型敏感，而另外3例為基因型敏感而表型耐藥。
　　三、活病毒表型耐藥研究結(jié)果<

25、br>　　1、基因型耐藥結(jié)果:
　　4例患者均檢出NRTI或NNRTI耐藥突變。300149對(duì)AZT、d4T和EFV耐藥，對(duì)3TC和ddI敏感;300180對(duì)AZT、d4T、3TC和ddI敏感，對(duì)EFV耐藥;300130對(duì)AZT、ddI和d4T敏感，對(duì)3TC和EFV耐藥;300494對(duì)ddI、d4T、AZT、3TC和EFV均耐藥。
　　2、實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)毒株表型耐藥檢測(cè):
　　用實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)毒株SF33來(lái)檢測(cè)TZM-bl細(xì)胞

26、方法的敏感性，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，利用Graphpad Prism V5.0軟件計(jì)算每種藥物對(duì)病毒的IC50。AZT、ddI、d4T、ddI、3TC以及EFV對(duì)SF33毒株的IC50分別為(0.004±0.001)μM、(2.66±0.08)μM、(0.139±0.037)μM、(0.392±0.008)μM、(0.078±0.007)μM。
　　3、病毒株的表型耐藥結(jié)果:
　　300149和300180對(duì)AZT、d4T和3T

27、C敏感，對(duì)ddI和EFV耐藥;300130對(duì)AZT和d4T敏感，對(duì)ddI、3TC和EFV耐藥;300494對(duì)ddI和d4T敏感，對(duì)AZT、3TC和EFV耐藥。
　　4、活病毒表型耐藥與基因型耐藥結(jié)果比較:
　　ddI:100％不一致，d4T:50％不一致，AZT:25％不一致，EFV和3TC的結(jié)果無(wú)不一致。
　　5、活病毒與假病毒表型耐藥性結(jié)果比較:
　　分別檢測(cè)兩株病毒對(duì)五種藥物的表型耐藥，共得到10個(gè)結(jié)果，其

28、中9個(gè)結(jié)果在耐藥解釋及耐藥程度上均高度一致，僅300494毒株對(duì)于AZT的耐藥結(jié)果存在程度上的差異（假病毒方法為中度耐藥，而活病毒方法為高度耐藥）。
　　結(jié)論：
　　1、我國(guó)抗病毒治療平均5年以上病毒學(xué)失敗艾滋病患者耐藥突變率為100％，顯著高于國(guó)內(nèi)治療時(shí)間在3年以內(nèi)的人群的耐藥突變率。該人群對(duì)NNRTI和NRTI均呈高水平耐藥。出現(xiàn)頻率較高的耐藥突變?yōu)镸41 L(59.3％)、T215Y(44.4％)、L210W(40.7

29、％)、K103N(40.7％)和K70R(33.3％)。與國(guó)內(nèi)治療時(shí)間在3年以內(nèi)的患者相比，檢測(cè)到未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的K219N、V90I、V106I和H221C耐藥突變位點(diǎn)。未發(fā)現(xiàn)蛋白酶抑制劑主要耐藥突變。
　　2、在國(guó)內(nèi)首次應(yīng)用假病毒的方法對(duì)我國(guó)長(zhǎng)期抗病毒治療后病毒學(xué)失敗艾滋病患者共16株病毒的表型耐藥進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)基因型耐藥檢測(cè)與假病毒表型耐藥檢測(cè)存在不一致的結(jié)果。現(xiàn)有的斯坦福耐藥數(shù)據(jù)庫(kù)不能對(duì)我國(guó)長(zhǎng)期抗病毒治療失敗患者的基因型耐