低氧預(yù)適應(yīng)增強大鼠海馬神經(jīng)元缺氧耐受性與Mito-K-,ATP-作用機制的研究.pdf

1、低氧預(yù)適應(yīng)(Hypoxicpreconditioning，PC)是指用非致死性低濃度氧，通過反復(fù)暫短刺激使機體器官、組織和細(xì)胞對隨后更嚴(yán)重缺氧產(chǎn)生耐受性，從而產(chǎn)生重要的保護作用，它是機體特有的內(nèi)源性保護現(xiàn)象。有關(guān)低氧預(yù)適應(yīng)產(chǎn)生保護機制的研究已涉及眾多方面，包括酶、活性氧、受體、遞質(zhì)、抗凋亡物質(zhì)及離子通道等。盡管有相關(guān)多篇文獻(xiàn)報道，但關(guān)于低氧預(yù)適應(yīng)的確切機制仍為闡明，并且有的還存在著嚴(yán)重的爭議，另外，關(guān)于低氧預(yù)適應(yīng)產(chǎn)生的保護作用對臨床中腦

2、缺氧、缺血和其他腦血管疾病，以及對高原、高山、航空、航天和潛水等特殊環(huán)境中腦損害的治療有著直接的意義，所以，腦低氧預(yù)適應(yīng)產(chǎn)生的保護作用機制的研究，無論在基礎(chǔ)領(lǐng)域還是在臨床實踐應(yīng)用范圍，都有重要的研究價值。 低氧預(yù)適應(yīng)現(xiàn)象最早于1986年由Schurr等[1]在大鼠海馬腦片上發(fā)現(xiàn)，迄今近二十年的歷史，在低氧預(yù)適應(yīng)產(chǎn)生腦保護作用機制的研究中，其中ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitivepotassiumchannels，KAT

3、P)無論是從1983年后由Noma等[2]在心肌細(xì)胞膜上首次發(fā)現(xiàn)已來，還是到1991年Inoue等[3]在線粒體內(nèi)膜發(fā)現(xiàn)以后，一直是腦低氧預(yù)適應(yīng)機制研究中的一個焦點。但是，2000年以前眾多研究者的目光多注重在細(xì)胞膜上的KATP，并且已有相關(guān)文獻(xiàn)報道[4-6]。線粒體內(nèi)膜KATP直到1997年后才引起人們的注意，Garlid等[10]在研究心肌細(xì)胞缺氧/缺血保護時，發(fā)現(xiàn)與過去利用KATP激動劑二氮嗪能縮短心肌細(xì)胞動作電位時程對心肌有保護

4、作用的結(jié)論相矛盾的現(xiàn)象，實驗者利用低濃度的二氮嗪(毫摩爾水平)時，對心肌缺氧/缺血有保護作用，但對心肌細(xì)胞的動作電位時程無影響，提出低濃度的二氮嗪不是作用在胞膜上KATP，而是通過線粒體內(nèi)膜KATP對心肌起保護作用。2002年N.rajapakse等[1]首次報道了腦線粒體KATP(mitochondriaATP-sensitivepotassiumchannels，mito-KATP)對新生大鼠腦缺氧/缺血有保護作用。2003年Tai

5、kk等[12]首次報道激活mito-KATP，能對抗魚藤酮對PC12細(xì)胞的毒性作用。但腦低氧預(yù)適應(yīng)產(chǎn)生的保護機制與線粒體KATP的之間關(guān)系的研究結(jié)果至今未見報道。海馬神經(jīng)元對缺氧和缺血非常敏感的特點，一直被用來作為研究缺血和缺氧的主要模型?；谝陨显?，本工作旨在利用大鼠海馬神經(jīng)元低氧預(yù)處理模型，研究線粒體內(nèi)膜KATP在低氧預(yù)適應(yīng)保護機制的作用。 本工作包括以下幾個方面：1從成年大鼠整體水平到培養(yǎng)成熟海馬神經(jīng)元單個細(xì)胞水平上，建

6、立低氧預(yù)適應(yīng)模型，進行研究低氧預(yù)適應(yīng)對再次急性缺氧的耐受性。 其中研究海馬神經(jīng)細(xì)胞耐缺氧指標(biāo)包括：①在整體水平制備好低氧預(yù)適應(yīng)模型后，立即制成離體的海馬切片，在海馬腦片中對缺氧最為敏感的CA1的椎體神經(jīng)元，進行膜片鉗全細(xì)胞記錄模式記錄，再對腦片進行缺氧，利用超極化電位、膜電位去極化水平及記錄神經(jīng)元存活等指標(biāo)研究低氧預(yù)適應(yīng)組海馬神經(jīng)元是否比對照組有明顯的耐缺氧能力。 ②在培養(yǎng)成熟的海馬神經(jīng)元單個細(xì)胞水平上研究低氧預(yù)適應(yīng)對再

7、次急性缺氧的產(chǎn)生的耐受性，具體通過計算急性缺氧后兩組神經(jīng)元的存活率。 ③通過動態(tài)觀察急性缺氧過程中細(xì)胞內(nèi)鈣熒光的變化，來反映細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)定情況作為判斷細(xì)胞對耐缺氧能力的一個指標(biāo)。 ④通過動態(tài)觀察急性缺氧過程中細(xì)胞內(nèi)羅丹明熒光的變化，來反映細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位穩(wěn)定情況作為判斷細(xì)胞對耐缺氧能力的又一個指標(biāo)。 通過上述四部分內(nèi)容證明了低氧預(yù)適應(yīng)后，海馬神經(jīng)元對再次急性缺氧有明顯的耐受性。實驗結(jié)果表現(xiàn)為：a低氧預(yù)適應(yīng)組的

8、海馬腦片在急性缺氧過程中存活時間明顯比對照組長。 b低氧預(yù)適應(yīng)組的海馬神經(jīng)元急性缺氧后，細(xì)胞存活率明顯高于對照組。 c低氧預(yù)適應(yīng)組的海馬神經(jīng)元在急性缺氧過程中細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度比對照組明顯穩(wěn)定。 d低氧預(yù)適應(yīng)組的海馬神經(jīng)元在急性缺氧過程中，線粒體膜電位比對照組明顯穩(wěn)定。 2利用線粒體內(nèi)膜特異性的ATP敏感性鉀通道阻斷劑和細(xì)胞膜特異性的ATP敏感性鉀通道阻斷劑，對上述低氧預(yù)適應(yīng)產(chǎn)生的耐缺氧能力進行特異性阻斷，

9、以來判定低氧預(yù)適應(yīng)產(chǎn)生的保護作用，具體是通過哪種ATP敏感性鉀通道產(chǎn)生。 利用兩種特異性阻斷劑對上述低氧預(yù)適應(yīng)產(chǎn)生的耐缺氧能力干預(yù)的研究結(jié)果表明：a線粒體內(nèi)膜特異性的ATP敏感性鉀通道阻斷劑5-DH能明顯縮短低氧預(yù)適應(yīng)組的海馬腦片在急性缺氧過程中存活時間。 b線粒體內(nèi)膜特異性的ATP敏感性鉀通道阻斷劑5-DH明顯降低預(yù)適應(yīng)組的海馬神經(jīng)元急性缺氧后的細(xì)胞存活率。 c線粒體內(nèi)膜特異性的ATP敏感性鉀通道阻斷劑5-DH

10、明顯降低預(yù)適應(yīng)組的海馬神經(jīng)元在急性缺氧過程中細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的穩(wěn)定性。 d線粒體內(nèi)膜特異性的ATP敏感性鉀通道阻斷劑5-DH明顯降低預(yù)適應(yīng)組的海馬神經(jīng)元在急性缺氧過程中的線粒體膜電位穩(wěn)定性。 但應(yīng)用細(xì)胞膜特異性的ATP敏感性鉀通道阻斷劑tolbutamide對上述變化沒有明顯的影響。 3利用westernblot蛋白印記分析抗細(xì)胞凋亡蛋白bcl-2表達(dá)。同時運用兩種特異性的ATP敏感性鉀通道阻斷劑，以分析低氧預(yù)適

11、應(yīng)產(chǎn)生的保護作用是否與凋亡途徑相關(guān)，以及這種相關(guān)性是否與ATP敏感性鉀通道有聯(lián)系。 實驗結(jié)果表明，低氧預(yù)適應(yīng)組的bcl-2表達(dá)量比對照組有所增加，事先運用線粒體內(nèi)膜特異性的ATP敏感性鉀通道阻斷劑和細(xì)胞膜特異性的ATP敏感性鉀通道阻斷劑后，加入線粒體內(nèi)膜特異性的ATP敏感性鉀通道阻斷劑5-HD能減低低氧預(yù)適應(yīng)組的bcl-2表達(dá)量，而應(yīng)用細(xì)胞膜特異性的ATP敏感性鉀通道阻斷劑tolbutamide后，對低氧預(yù)適應(yīng)組的bcl-2表達(dá)

12、量沒有明顯變化。 小結(jié)：本工作先后在成年大鼠整體水平和培養(yǎng)成熟的單個海馬神經(jīng)元的細(xì)胞水平上進行了低氧預(yù)適應(yīng)的模型制備，利用了海馬腦片的膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)方法、細(xì)胞記數(shù)計算神經(jīng)元存活率方法、熒光共聚焦動態(tài)檢測急性缺氧過程中的海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子和線粒體膜電位穩(wěn)定的技術(shù)方法及westernblot蛋白印記分析技術(shù)方法，對低氧預(yù)適應(yīng)組海馬神經(jīng)元對再次急性缺氧產(chǎn)生的耐受性進行了研究，又利用線粒體內(nèi)膜特異性的ATP敏感性鉀通道阻斷劑和

13、細(xì)胞膜特異性的ATP敏感性鉀通道阻斷劑對上述作用的干涉研究，發(fā)現(xiàn)低氧預(yù)適應(yīng)的海馬神經(jīng)元對再次急性缺氧有明顯的耐受性，并且該作用可被線粒體內(nèi)膜特異性的ATP敏感性鉀通道阻斷劑明顯降低，但細(xì)胞膜特異性的ATP敏感性鉀通道阻斷劑沒有明顯作用。得出結(jié)論：低氧預(yù)適應(yīng)產(chǎn)生保護作用機制與線粒體ATP敏感性鉀通道的關(guān)系更為重要，而與細(xì)胞膜ATP敏感性鉀通道無明顯關(guān)系。另外，本工作也是首次在成年大鼠海馬切片，利用膜片鉗技術(shù)得出低氧預(yù)適應(yīng)能使海馬神經(jīng)細(xì)胞的