機械牽張原代人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞建立MicroRNAs異表達(dá)譜.pdf

1、背景：
　　急性呼吸窘迫綜合綜（acute respiratory distress syndrome，ARDS）患者通常需要人工通氣輔助治療以改善氧合。而機械通氣治療 ARDS過程中常常會引發(fā)呼吸機相關(guān)性肺損傷(Ventilation induced lung injury，VILI)，且與之相關(guān)的死亡率高達(dá)34~60％。機械通氣導(dǎo)致肺損傷的主要作用機制包括：氣壓傷、容積傷、萎陷傷、生物傷。不適當(dāng)?shù)臋C械通氣導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞和毛細(xì)

2、血管內(nèi)皮細(xì)胞受損、毛細(xì)血管基底膜暴露,引起局部炎癥細(xì)胞激活和炎癥反應(yīng)放大,誘導(dǎo)或加重肺損傷,即生物傷。目前防治VILI的策略方面還不夠完善。主要針對其發(fā)生機制采取保護性通氣策略。雖然一定程度降低了ARDS的病死率，但ARDS病死率仍然較高，急需對VILI發(fā)生、發(fā)展的具體分子調(diào)節(jié)機制進(jìn)行探討，以期找出新的防治策略。
　　肺泡 II型上皮細(xì)胞是機械通氣損傷的主要靶點之一,是機械力造成肺部生物傷的始動環(huán)節(jié)。肺泡II型上皮細(xì)胞作為一種組織

3、干細(xì)胞，具有十分重要的功能，能夠分泌抗炎、抗菌物質(zhì)，因此深入研究機械通氣對肺泡 II型上皮細(xì)胞功能的影響，有助于明確VILI所致炎性反應(yīng)發(fā)生、發(fā)展的具體分子調(diào)節(jié)機制。
　　近年來，大量研究證實，miRNA參與了免疫反應(yīng)調(diào)控。深入探索肺泡 II型上皮細(xì)胞miRNA對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機制,不僅能明確miRNA的在各炎癥通路的調(diào)節(jié)作用,而且能在基因調(diào)控層面對呼吸機相關(guān)性肺損傷的防治提供新的線索。
　　目的：
　　建立原代人肺泡

4、 II型上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定的方法；機械牽張原代人肺泡II型上皮細(xì)胞建立miRNAs差異表達(dá)譜，找出顯著差異表達(dá)的miRNA。
　　方法：
　　1、原代人肺泡 II型上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定：以肺葉切除患者的肺組織作為組織來源，首先用胰酶與彈性蛋白酶聯(lián)合法消化成人非腫瘤的邊緣肺組織，再經(jīng)細(xì)胞篩過濾、差速貼壁、梯度分離液分離以及Anti-CD14磁珠分選純化細(xì)胞，然后將得到的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。通過 RT-PCR檢測特異性基因的表

5、達(dá)，pro-SP-C、CK-8雙標(biāo)免疫熒光染色、LysoTracker? Green DND-26熒光分子探針染色、透射電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行細(xì)胞鑒定；同時用pro-SP-C、DND-26著色情況評估細(xì)胞純度。
　　2、細(xì)胞表型維持及反應(yīng)性檢測：運用不同培養(yǎng)基與不同血清濃度的組合，研究其對細(xì)胞表型維持的影響；運用RT-PCR監(jiān)測培養(yǎng)過程中代表肺泡II型上皮細(xì)胞表型的基因（SP-A，SP-B，SP-C，SP-D，CK-8，KL-

6、6，AQP-3）的表達(dá)變化，評估體外培養(yǎng)的肺泡II型上皮細(xì)胞生物學(xué)特性的維持情況；并運用RT-PCR、ELISA法檢測 TNF-a刺激原代培養(yǎng)的肺泡 II型上皮細(xì)胞相關(guān)炎癥因子（IL-6，IL-8，MCP-1，ICAM-1）的表達(dá)情況來觀察其反應(yīng)性(n=3)。
　　3、機械牽張人肺泡 II型上皮細(xì)胞構(gòu)建 miRNAs差異表達(dá)譜：分離培養(yǎng)原代人肺泡 II型上皮細(xì)胞，以5.5×105個/孔接種牽張板（BF-3001C），周期性牽張，減

7、速波（DC%=50%），%Elongation=0%、5%或20%，作用時間30h，每組設(shè)一個復(fù)孔。處理完成后，以1ml/孔TRIzol試劑收集3組樣品總RNA于1.5mlEP管中，-70℃保存。由康成生物技術(shù)有限公司進(jìn)行 miRNAs芯片分析，建立芯片差異表達(dá)譜（n=3）。
　　結(jié)果：
　　1、原代人肺泡 II型上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定：運用這種方法，每克邊緣肺組織經(jīng)分離、純化后平均可獲取ATⅡ細(xì)胞為6×105-1×106

8、（n=36），pro-SP-C和Lysotrack? Green DND-26染色評估細(xì)胞純度可達(dá)(98土2)％（n=36），0.4％臺盼藍(lán)染色評估細(xì)胞的活力為(96土2)％（n=36）。pro-SP-C、CK-8雙標(biāo)免疫熒光、Green DND-26熒光分子探針、透射電鏡均證實該方法培養(yǎng)的細(xì)胞為肺泡II型上皮細(xì)胞。
　　2、細(xì)胞表型維持及反應(yīng)性檢測：通過比較不同培養(yǎng)基以及血清濃度對ATII細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)10%FBS或DMEM均

9、不適合維持細(xì)胞的表型，而SAGM+1%FBS能較好地維持細(xì)胞表型。Cytokeratin-8和KL-6作為上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白表達(dá)持續(xù)性較好。更重要的是SP-A,SP-B，SP-C,SP-D持續(xù)表達(dá)超過20天，尤其是SP-B，SP-D在培養(yǎng)的第28天時仍然有明顯表達(dá)。代表肺泡II型上皮細(xì)胞表型的AQP-3也持續(xù)表達(dá)超過20天,同時代表肺泡I型上皮細(xì)胞表型AQP-5始終為低表達(dá)。用不同濃度的TNF-a處理原代培養(yǎng)的肺泡II型上皮細(xì)胞的結(jié)果表

10、明,炎癥因子(IL-6，IL-8，MCP-1，ICAM-1) mRNA表達(dá)水平隨著 TNF-a刺激強度的增加而增多；而且用ELISA方法在細(xì)胞培養(yǎng)上清中也觀察到了同樣的現(xiàn)象。
　　3、機械牽張肺泡II型上皮細(xì)胞構(gòu)建MicroRNAs差異表達(dá)譜：經(jīng)過一系列篩選之后,共有112個可納入進(jìn)一步的數(shù)據(jù)比較分析，其中A20/A0有49個上調(diào)、63個下調(diào)，A5/A0有13個上調(diào)、15個下調(diào)。上調(diào)最高可達(dá)104.8倍，下調(diào)最高可達(dá)57.1倍。<