鼻咽癌可視化動(dòng)物模型的建立.pdf

1、分子影像學(xué)可實(shí)現(xiàn)在活體生物內(nèi)細(xì)胞、基因和分子水平的生理或病理過程的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)無創(chuàng)成像，其中光學(xué)成像技術(shù)中的熒光技術(shù)和生物發(fā)光技術(shù)發(fā)展迅速，已廣泛應(yīng)用于各類腫瘤可視化動(dòng)物模型中，為研究活體內(nèi)腫瘤細(xì)胞與其周圍環(huán)境相互作用過程，提供了一種全新的監(jiān)測(cè)方法，為更清晰和深入地了解腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移提供了良好的平臺(tái)。
　　鼻咽癌(NPC)是東南亞、特別是我國(guó)南方數(shù)省常見的惡性腫瘤，作為一種有著鮮明特點(diǎn)的頭頸部腫瘤，其呈低分化，惡性程度高，

2、早期即可出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。建立人鼻咽癌可視化動(dòng)物模型，能促進(jìn)對(duì)鼻咽癌分子機(jī)制及診斷治療的深入研究。
　　首先，我們采用脂質(zhì)體法將熒光蛋白和熒光素酶基因表達(dá)質(zhì)粒（pEGFP-N1、p GL3-Control、Luc-DsRed2）導(dǎo)入人鼻咽癌細(xì)胞株中（5-8F、6-10B、CNE1-LMP1、C666-1），利用G418或潮霉素進(jìn)行壓力篩選。經(jīng)過20多天的篩選，我們挑取單獨(dú)穩(wěn)定表達(dá)熒光蛋白、單獨(dú)穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶及同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)熒光蛋

3、白和熒光素酶的亞克隆細(xì)胞株。其中具代表性的細(xì)胞株有:單獨(dú)穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的5-8F-GFP-F細(xì)胞株、單獨(dú)穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的5-8F-Luc-Z、同時(shí)表達(dá)綠色熒光蛋白和熒光素酶的5-8F-Luc-GFP-M及同時(shí)表達(dá)紅色熒光蛋白和熒光素酶的CNE1-LMP1-Luc-DsRed2-E細(xì)胞株。接著，我們分別利用上述4株細(xì)胞，通過皮下接種技術(shù)及裸鼠鼻咽原位接種技術(shù)，分別建立了裸鼠皮下移植瘤和裸鼠鼻咽原位移植瘤可視化動(dòng)物模型。
　　

4、結(jié)果證實(shí):5-8F-GFP-F細(xì)胞株和5-8F-Luc-Z細(xì)胞株在裸鼠皮下和鼻咽部均具有較好的成瘤能力，并能穩(wěn)定表達(dá)目的基因綠色熒光蛋白或者熒光素酶。在精諾真IVIS LuminaⅡ成像系統(tǒng)下，兩株細(xì)胞都分別成功的建立了裸鼠皮下移植瘤及鼻咽原位移植瘤可視化動(dòng)物模型。5-8F-GFP-F細(xì)胞株穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白，皮下移植瘤熒光信號(hào)定位清晰，能準(zhǔn)確的反映皮下腫瘤體積大小及生長(zhǎng)情況;與之相對(duì)應(yīng)的鼻咽原位移植瘤可視化動(dòng)物模型中，則需將裸鼠口腔

5、打開，才能夠采集到熒光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)鼻咽原位腫瘤的實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，這可能與裸鼠鼻咽腔周圍解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜及GFP深層組織穿透能力有限等因素有關(guān)。此外，裸鼠毛發(fā)等存在自發(fā)熒光干擾信號(hào)，這些因素，在一定程度上影響了GFP的適用范圍。在5-8F-Luc-Z細(xì)胞株建立的可視化動(dòng)物模型中，腹腔注射熒光素酶底物D-Luciferin后，無論是裸鼠皮下移植瘤還是鼻咽原位移植瘤，均能采集到很強(qiáng)的熒光信號(hào)，定位準(zhǔn)確、清晰、亦可實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)情況。

6、與GFP相比，熒光素酶靈敏度更高、深層組織穿透能力更強(qiáng)、幾乎無干擾背景，其建立的鼻咽癌可視化動(dòng)物模型具有其獨(dú)特之處。與此同時(shí)，為結(jié)合GFP和Luc兩者的優(yōu)點(diǎn)，我們通過共轉(zhuǎn)染方式將GFP和Luc兩者同時(shí)標(biāo)記5-8F-Luc-GFP-M細(xì)胞株，并建立了相應(yīng)可視化動(dòng)物模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn):兩種熒光均沒有檢測(cè)到，可能與綠色熒光蛋白和熒光素酶的表達(dá)水平均偏低有關(guān)，表明通過共轉(zhuǎn)染方式結(jié)合兩者，并應(yīng)用于可視化動(dòng)物模型的建立，有一定困難。此外，我們還將紅色熒

7、光蛋白和熒光素酶兩者整合到同一個(gè)載體Luc-DsRed2上，篩選出穩(wěn)定細(xì)胞株CNE1-LMP1-Luc-DsRed2-E并建立了相應(yīng)的人鼻咽癌可視化動(dòng)物模型。結(jié)果進(jìn)一步證實(shí):熒光素酶是很好的腫瘤細(xì)胞示蹤劑，無論體外還是體內(nèi)水平熒光素酶均能夠準(zhǔn)確示蹤腫瘤細(xì)胞，且細(xì)胞數(shù)越多，產(chǎn)生的熒光信號(hào)越強(qiáng);紅色熒光蛋白可能受基因本身表達(dá)水平、組織穿透能力及儀器靈敏度的多種因素影響，體內(nèi)水平監(jiān)測(cè)受限。
　　最后，我們?cè)贑NE1-LMP1-Luc-D

8、sRed2-E細(xì)胞株建立的人鼻咽癌可視化動(dòng)物模型基礎(chǔ)上，將臨床鼻咽癌一線治療藥物順鉑應(yīng)用到該模型中，比較了順鉑治療前后，鼻咽原位腫瘤熒光信號(hào)強(qiáng)度的變化情況，并用TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤組織的凋亡情況。研究證實(shí):順鉑能有效抑制鼻咽癌的生長(zhǎng)，并能通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡來治療鼻咽癌。此外，還發(fā)現(xiàn)鼻咽癌對(duì)局部顱底骨組織有侵襲作用，可能與LMP1相關(guān)。
　　綜上，本研究以多株穩(wěn)定表達(dá)熒光蛋白和熒光素酶的人鼻咽癌克隆細(xì)胞株為基礎(chǔ)，通過建立人鼻咽