豬氨基肽酶在MDCK細(xì)胞中的表達(dá)與鑒定.pdf

1、氨基肽酶(APN)是冠狀病毒的細(xì)胞感染受體，同屬于Ⅰ群冠狀病毒的豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、人冠狀病毒229E、貓冠狀病毒等都以相應(yīng)的氨基肽酶作為其細(xì)胞感染的受體。 本研究以pMD18-T-pAPN為模版，設(shè)計(jì)了一對帶有BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)的引物，將pAPN基因克隆出來并插入到真核表達(dá)載體pEFP-C1的BamHⅠ和HindⅢ位點(diǎn)之間，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pEGFP-C1-pAPN。經(jīng)公司測序，所插入的pAPN基因

2、連接位點(diǎn)正確，并利用三維蛋白空間結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件預(yù)測分析，pAPN基因可以和GFP基因融合表達(dá)，所表達(dá)出的蛋白的空間結(jié)構(gòu)相互沒有影響，與自然存在的蛋白結(jié)構(gòu)相符。選用PEDV非許可性細(xì)胞犬腎細(xì)胞(Madin-Darbycaninekidney,MDCK)，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至MDCK細(xì)胞中，利用載體pEFP-C1含有中新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶抗性基因的特性，向細(xì)胞培養(yǎng)液中添加新霉素抗性藥物G418篩選，同時運(yùn)用熒光檢測手段，實(shí)時檢測G

3、FP蛋白的表達(dá)情況。經(jīng)過篩選，篩選出了幾株有G418抗性MDCK細(xì)胞系，此時，提取該MDCK細(xì)胞的總RNA，用OligdT將mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，針對pAPN基因設(shè)計(jì)一對檢測引物進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，檢測出了3株轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞有pAPN基因mRNA轉(zhuǎn)錄。用PEDV對該3株MDCK細(xì)胞系進(jìn)行感染，有2株產(chǎn)生細(xì)胞病變，證明了pAPN在MDCK細(xì)胞中表達(dá)；同時將該MDCK細(xì)胞傳10代后，去除選擇壓力G418藥物，并續(xù)傳至20代后，PEDV感染