廣東及周邊省份豬流行性腹瀉分子流行病學調查及豬氨基肽酶N多抗的制備.pdf

1、2010年十月，我國大面積爆發(fā)豬流行性腹瀉（PED），在短短一年時間內，造成多個省份超過100萬頭豬死亡，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經濟損失。廣東省作為全國養(yǎng)豬大省，在此之后，雖大部分豬場均采用疫苗免疫預防PED，但效果并不理想。
　　本次實驗中，采集2015-2016年廣東省及周邊省份臨床表現為腹瀉的樣品共178份，通過RT-PCR對這些樣品進行PEDV、TGEV、RV檢測，選取20個PEDV陽性樣品，通過RT-PCR擴增毒株的S

2、基因全序列、M基因全序列以及ORF3基因全序列并克隆至載體測序，并與GenBank已經發(fā)布的毒株序列比較，分析廣東省及周邊省份PED流行毒株的遺傳進化關系，核苷酸序列及氨基酸序列同源性以及序列位點變化。
　　本實驗178份樣品中，有137份樣品顯示PED陽性，6份樣品顯示TGE陽性，10份樣品顯示RV陽性，陽性率分別為77.0％、3.4%、5.6%。從結果中可看出，冬季與春季PED的陽性率明顯高于其他兩季。從S基因遺傳進化關系來看

3、，本實驗所得20個 PEDV毒株均與中國2010年之后分離毒株 CH/GDZQ/2014與CH/HNLH/2015親緣關系較近。分析S基因及其編碼蛋白序列，與經典毒株CV777比較，有15個堿基插入與6個堿基的缺失，導致N58Q/HGV61和N140氨基酸插入， D164I165氨基酸缺失。比較其四個抗原表位，分別具有10～15個氨基酸的變異。分析M基因遺傳進化關系可知，20個樣品核苷酸同源性為97.2%～100.0%，氨基酸同源性96

4、.5%～100%，與CV777、83P-5、Br1/87之間的核苷酸同源性為97.5%～99.6%，氨基酸同源性為97.4%～99.1%，說明M基因較為保守。實驗中M基因與近年來的流行毒株一樣具有3個氨基酸突變。分析20株毒株的ORF3基因可知20個毒株均為675bp，沒有缺失，屬于流行強毒株。同源性分析表明20個樣品之間核苷酸同源性為98.2%～100.0%，氨基酸同源性98.2%～100.0%，同源性較高，與 DR13同源性較高，核

5、苷酸同源性為97.9%～98.4%，氨基酸同源性為98.2%～99.6%。分析其氨基酸序列發(fā)現具有8個氨基酸突變，與韓國毒株DR13非常相似。這些結果表明，廣東省及其周邊省份豬場中普遍存在豬流行性腹瀉病毒，其基因也在不斷變化。
　　為了進一步了解廣東省及其周邊省份 PED流行毒株的性質、功能及感染特性，因此需要深入了解作為PEDV受體的豬氨基肽酶N（pAPN）的基本性質，作用方式以及其功能特性，并為后續(xù)實驗做準備。根據GenBan

6、k中登錄號為NM_214277的豬氨基肽酶 N序列設計一段引物，擴增其中1176bp，將擴增產物克隆至表達載體 pET-32a中，構建重組質粒pET-32a-APN-C。將重組質粒轉化至E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，優(yōu)化IPTG誘導條件，表達與預期大小相符的約53kDa的蛋白，可溶性分析結果表示其蛋白主要存在于包涵體中。將融合蛋白純化后，免疫新西蘭白兔制備多克隆抗體。3次免疫后心臟采血，通過免疫印跡試驗檢測其特異性，并用