華南部分地區(qū)家豬流行性乙型腦炎病毒感染的流行病學(xué)調(diào)查.pdf

1、目的：
　　本研究在華南部分地區(qū)對(duì)成年家豬乙腦病毒的帶毒和血清抗體開展調(diào)查，了解家豬間乙腦的流行狀況，以便為乙腦的防制提供科學(xué)信息。
　　鑒于目前我國(guó)市場(chǎng)上的商品化豬JEV IgG抗體ELISA檢測(cè)試劑盒品牌眾多，質(zhì)量參差不齊，給應(yīng)用者選擇帶來了一定的困難，我們?cè)诒狙芯恐幸矊?duì)目前國(guó)產(chǎn)主要商品化IgG抗體ELISA試劑盒的真實(shí)性和可靠性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。
　　方法：
　　1.豬血樣本的采集與處理
　　2013年1月

2、至8月期間，赴廣東省、海南省和江西省部分地區(qū)的屠宰場(chǎng)或肉聯(lián)廠無菌采集6～8月齡表觀健康、未行乙腦疫苗免疫的家豬的血液樣本。所有采集到的豬血液樣本3000r/min離心15min，取離心后的血清混勻平均分裝，一式3份，冰袋或者干冰運(yùn)輸回實(shí)驗(yàn)室后，-80℃保存待檢。
　　2.豬乙腦病毒IgG抗體診斷試劑盒評(píng)價(jià)
　　選用三種常用的商品化豬JEV IgG抗體ELISA試劑盒(Keqian、Lvshiyuan及Tianchen)，以微

3、量中和試驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)90份豬血清進(jìn)行平行檢測(cè)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)。ELISA試劑盒的檢測(cè)嚴(yán)格按照各自說明書進(jìn)行操作，微量中和試驗(yàn)嚴(yán)格按照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS214-2008的指導(dǎo)進(jìn)行操作。
　　3.豬乙腦病毒感染的流行病學(xué)調(diào)查
　　3.1 豬血清乙腦病毒檢測(cè)和分離
　　3.1.1 ELISA方法初篩豬血清樣本乙腦病毒抗原陽性標(biāo)本
　　用商用豬血清JEV-Ag ELISA試劑盒初篩豬血清樣本，嚴(yán)格按

4、照試劑盒說明書進(jìn)行操作。陽性者進(jìn)一步進(jìn)行病毒增殖和分離。
　　3.1.2 染毒BHK-21細(xì)胞
　　單層乳倉(cāng)鼠腎(Baby Hamster Syrian Kidney，BHK-21)細(xì)胞分別接種ELISA初篩為抗原陽性的豬血清樣本，Minimum Essential Medium培養(yǎng)基(MEM)液為空白對(duì)照。持續(xù)觀察7天后收集細(xì)胞病毒液，-80℃冰箱凍存待檢。期間，若出現(xiàn)疑似細(xì)胞病變的現(xiàn)象，如細(xì)胞死亡或出現(xiàn)變圓、脫落、聚集等

5、形態(tài)改變，初步判為陽性。若無細(xì)胞形態(tài)改變或改變不明顯，盲傳三代，如仍未有形態(tài)改變，且TaqMan Real-time PCR檢測(cè)為陰性，則判為陰性。
　　3.1.3 類中和試驗(yàn)
　　將10倍稀釋的可疑陽性樣本與不同濃度的豬乙腦病毒IgG抗體等體積混合，37℃孵育1h后接種至BHK-21細(xì)胞，乙腦病毒中山株(Nakayama)為陽性對(duì)照，MEM液為空白對(duì)照。37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，每天記錄細(xì)胞病變情況，觀察豬乙腦

6、病毒IgG抗體對(duì)可疑病毒的保護(hù)作用。
　　3.1.4 可疑病毒增殖
　　將經(jīng)上述篩選過程判斷為可疑乙腦病毒陽性標(biāo)本(JH12、JH33、HK121、HK151、HK212)過濾后染毒BHK-21細(xì)胞，盲傳三代，進(jìn)行細(xì)胞增殖。將細(xì)胞增殖病變液反復(fù)凍融3次，離心，過濾取上清液，和陽性對(duì)照（Nakayama株病毒液）、陰性對(duì)照（MEM液）一起，顱內(nèi)各接種一窩3日齡NIH乳鼠進(jìn)行病毒增殖，持續(xù)觀察2周。接種24h內(nèi)每2h觀察1次，2

7、4h后每天觀察3次。解剖瀕死小鼠，取部分腦組織于RNA later保存，用于TaqMan Real-time PCR檢測(cè)乙腦病毒，另一部分腦組織用10％甲醛溶液固定后，制作病理切片，鏡下觀察病變情況。觀察期內(nèi)若無癥狀出現(xiàn)，則連續(xù)盲傳三代，如仍未出現(xiàn)發(fā)病癥狀，且經(jīng)TaqMan Real-time PCR檢測(cè)后為陰性，則判斷為陰性。
　　3.1.5 TaqMan Real-time PCR檢測(cè)可疑陽性樣本
　　用Roche Hi

8、gh Pure viral RNA kit提取可疑陽性樣本中的病毒RNA，再用Roche Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成相應(yīng)的cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，用TaqMan Real-time PCR法檢測(cè)乙腦病毒（先制作標(biāo)準(zhǔn)曲線）。
　　3.1.6 TaqMan Real-time PCR檢測(cè)所有豬血清樣本
　　當(dāng)上述流程未成功篩選分離出乙腦病毒

9、時(shí)，為避免中間環(huán)節(jié)可能出現(xiàn)的差錯(cuò)，對(duì)所有豬血清樣本，統(tǒng)一提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再進(jìn)行Real-timeRT-PCR檢測(cè)。
　　3.2 豬血清乙腦病毒IgG抗體檢測(cè)
　　為保證研究進(jìn)度，在豬JEV IgG抗體ELISA試劑盒評(píng)價(jià)尚未完成之前，結(jié)合部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果、廠家信譽(yù)、市場(chǎng)占有率和價(jià)格進(jìn)行評(píng)估，選用Keqian豬JEV IgG抗體ELISA試劑盒，檢測(cè)全部465份豬血清樣本的JEV IgG抗體陽性情況。
　　4

10、.質(zhì)量控制
　　實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、準(zhǔn)備和實(shí)施的過程中，同時(shí)開展嚴(yán)格的質(zhì)量控制工作，遵守實(shí)驗(yàn)室安全守則，以保證實(shí)驗(yàn)科學(xué)、安全和順利進(jìn)行。
　　結(jié)果：
　　1.豬血清樣本
　　于2013年1月至8月期間，赴廣東省、海南省和江西省部分地區(qū)的屠宰場(chǎng)或肉聯(lián)廠收集當(dāng)?shù)?～8月齡表觀健康、未行乙腦疫苗免疫的家豬的血清樣本共465份。
　　2.豬乙腦病毒IgG抗體診斷試劑盒評(píng)價(jià)
　　2.1 三種ELISA試劑盒檢測(cè)豬血清乙腦

11、病毒IgG抗體的結(jié)果
　　對(duì)90份豬血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，微量中和試驗(yàn)的陽性檢出率為34.4％(31/90)，Keqian、Lvshiyuan和Tianchen陽性檢出率分別為50.0％(45/90)、47.8％(43/90)和38.9％(35/90)。與微量中和試驗(yàn)比較，靈敏度最高的是Keqian，為90.32％，其特異度為71.19％，Tianchen的靈敏度和特異度分別為83.87％和79.66％，Lvshiyuan的靈敏度和特

12、異度分別為41.94％和16.95％。與微量中和試驗(yàn)比較，Tianchen的κ系數(shù)最高，為0.63;其次是Keqian，為0.57; Lvshiyuan僅為0.04。
　　三種試劑盒同一批次檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性高，即均有較高的批次內(nèi)穩(wěn)定性。
　　3.豬乙腦病毒感染率
　　3.1 豬血清乙腦病毒檢測(cè)情況
　　用上海瓦蘭生物有限公司生產(chǎn)的商用豬血清JEV-Ag ELISA試劑盒初篩465份豬血清樣本，共得到43份JEV抗原

13、陽性樣本，陽性率9.25％。
　　陽性標(biāo)本接種BHK-21細(xì)胞，24份染毒的細(xì)胞與陰性對(duì)照無明顯區(qū)別，19份樣本在接種第2天時(shí)開始陸續(xù)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞死亡或細(xì)胞出現(xiàn)變圓、脫落、聚集等形態(tài)改變，部分呈菌落狀聚集病變。將出現(xiàn)病變的19份樣本過濾，重新染毒BHK-21細(xì)胞，三代盲傳，得到11份有持續(xù)致病變能力的可疑樣本。將11份可疑樣本與購(gòu)買的乙腦病毒抗體一同進(jìn)行類中和試驗(yàn)，有5份樣本能夠被乙腦病毒抗體保護(hù)，分別命名為JH12、JH33、

14、HK121、HK151和HK212。這5份可疑乙腦病毒陽性血清標(biāo)本接種乳鼠，乳鼠均于接種后20～30h內(nèi)死亡，接種同一樣本的同一窩乳鼠死亡時(shí)間差不超過3h，乳鼠死亡時(shí)無明顯特征反應(yīng)。但是，所有樣本用TaqMan Real-time PCR檢測(cè)均為乙腦病毒陰性。
　　鑒于以上流程未成功分離到乙腦病毒，為避免中間環(huán)節(jié)可能出現(xiàn)的差錯(cuò)，將所有豬血清樣本統(tǒng)一提取RNA進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)，部分血清量不夠用于提取RNA的樣本(＜

15、200μl)未納入檢測(cè)。合計(jì)檢測(cè)437份豬血清樣本乙腦病毒特異性核酸，Real-time PCR檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果。
　　3.2 豬血清乙腦病毒IgG抗體檢測(cè)結(jié)果
　　ELISA方法（Keqian，生產(chǎn)批號(hào)為131005）檢測(cè)465份豬血清樣本，JEV IgG抗體檢出率高達(dá)95.7％，其中7、8月采集的豬血清樣本的檢出率近乎100％。不同生產(chǎn)批號(hào)（130101和131005）試劑盒檢測(cè)的陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=26.0

16、4，P＜0.001)，κ系數(shù)等于0.378。
　　結(jié)論：
　　1.目前國(guó)內(nèi)商品化豬JEV IgG抗體ELISA檢測(cè)試劑盒診斷結(jié)果差異較大;與微量中和試驗(yàn)相比，存在較高的假陽性率。說明試劑盒質(zhì)量有待提高。
　　2.對(duì)廣東省、海南省和江西省當(dāng)?shù)?～8月齡表觀健康、未行乙腦疫苗免疫的家豬的血清樣本進(jìn)行乙腦病毒攜帶檢測(cè)，乙腦病毒陽性率為9.25％，但未檢測(cè)到乙腦病毒核酸，也未分離到乙腦病毒株;乙腦病毒IgG抗體陽性率高達(dá)95.