血漿循環(huán)DNA變異在預(yù)測肝癌肝移植預(yù)后中的價(jià)值研究.pdf

1、肝細(xì)胞肝癌(HCC，以下簡稱肝癌)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，多發(fā)于東南亞及非洲，病毒性肝炎及黃曲霉毒素是目前已明確的致癌高危因子。近年來，由于丙肝的流行，歐洲及北美的肝癌發(fā)病率呈上升趨勢。在我國，肝癌是第二位腫瘤殺手，每年30余萬人死于肝癌，全世界每年的新發(fā)病例55％來自中國[1]。手術(shù)切除是肝癌的首選治療方式。但80％肝癌發(fā)生在病毒性肝炎的基礎(chǔ)上，肝炎肝硬化導(dǎo)致的肝功能不全常常使患者失去手術(shù)機(jī)會(huì)。肝移植能徹底切除腫瘤并修復(fù)肝功能，

2、成為肝癌合并肝硬化根治性治療的理想治療方法[2]。然而，供體的緊缺限制了肝癌肝移植的臨床推廣。為了有效的利用有限的供肝，在移植術(shù)前對肝癌患者進(jìn)行預(yù)后評估對合理分配供肝有重要意義。
　　肝癌的發(fā)生發(fā)展是癌基因及抑癌基因改變、累積的結(jié)果。癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活是肝癌發(fā)生發(fā)展的重要因素[3]。我所前期的研究發(fā)現(xiàn)促使肝癌轉(zhuǎn)移的基因改變發(fā)生在原發(fā)腫瘤階段[4]。因此尋找與肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)相關(guān)的遺傳學(xué)改變并應(yīng)用于肝癌肝移植預(yù)后判斷具有

3、可行性。
　　基于芯片的高通量單核苷酸多態(tài)性分析使全基因組范圍的遺傳分析成為可能。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是基因組中最常見的遺傳學(xué)變異，是第三代遺傳學(xué)標(biāo)志。相對于第二代遺傳學(xué)標(biāo)記微衛(wèi)星重復(fù)序列，SNP具有數(shù)量巨大、穩(wěn)定性強(qiáng)和適于高通量掃描的優(yōu)點(diǎn)[5]。有文獻(xiàn)報(bào)道腫瘤組織來源的DNA某些SNP位點(diǎn)基因型頻率與正常組織來源的DNA基因型頻率不相同[6]。
　　但是，腫瘤組織的DNA只能在術(shù)后或術(shù)前穿刺活檢獲得，這使得其臨床應(yīng)用受

4、到限制。有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤來源的DNA能在腫瘤患者外周血(血漿/血清)中檢測到[7、8、9]。Diehl等發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌患者的循環(huán)DNA可以用來監(jiān)測手術(shù)治療的效果[10]。我所牛旗等在肝癌病人的血漿循環(huán)DNA中檢測到被認(rèn)為對乳腺癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)有預(yù)測價(jià)值的D14S51和D14S52兩個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)志的雜合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)，并認(rèn)為其與肝癌病人的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)密切相關(guān)[11]。
　　本課題擬在我所前期研究的基礎(chǔ)上

5、，利用高通量SNP芯片、飛行質(zhì)譜的方法，探索血漿循環(huán)DNA分子遺傳學(xué)變異(主要是SNP)在肝癌肝移植患者術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)預(yù)測中的價(jià)值，以期為現(xiàn)有肝癌肝移植適應(yīng)證的進(jìn)一步完善提供簡便、有效的檢測指標(biāo)；同時(shí)建立相應(yīng)的數(shù)學(xué)預(yù)測模型，推動(dòng)肝癌肝移植病例篩選的進(jìn)一步合理化；亦有助于移植術(shù)后個(gè)體化防治措施的開展。
　　第一部分肝癌肝移植患者腫瘤組織DNA的芯片雜交及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)相關(guān)SNP位點(diǎn)的篩選
　　目的：通過SNP芯片掃描肝癌肝移植患者腫瘤

6、組織DNA，研究肝癌患者基因組遺傳特征并篩選出轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)相關(guān)的SNP位點(diǎn)。
　　方法：將所有入選的肝癌肝移植病例分為復(fù)發(fā)組及未復(fù)發(fā)組，從每組中分別隨機(jī)挑選出15例。將FFPE組織切片后(10μm)在顯微鏡下獲取較純的腫瘤細(xì)胞(>80％)。
　　用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit試劑盒提取基因組DNA。Mapping PCR test檢測基因組DNA質(zhì)量。通過質(zhì)控的樣本經(jīng)DNA擴(kuò)增后取500ng進(jìn)行Affym

7、etrixSNP6.0芯片檢測。利用Genotyping Console3.0.1軟件進(jìn)行g(shù)enotyping分析。Cochran-Armitage trend test統(tǒng)計(jì)在復(fù)發(fā)和未復(fù)發(fā)兩個(gè)組中SNP基因型分布的差異，Cluster software(version3.0)和TreeView software(version1.0.13)進(jìn)行聚類分析。
　　結(jié)果：通過分析發(fā)現(xiàn)1272個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型在復(fù)發(fā)及未復(fù)發(fā)組中分布存在

8、差異(P<0.01)。其中P值小于0.001的SNP位點(diǎn)為30個(gè)。用這些差異位點(diǎn)對30例病人進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)可將這些病例分為兩群(即高危組和低危組)。用Kaplane-Meier法進(jìn)行生存分析發(fā)現(xiàn)，低危組的總體生存率和無復(fù)發(fā)生存率明顯高于高危組(P<0.001)。
　　結(jié)論：肝癌肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)可能與腫瘤組織中某些SNP位點(diǎn)的基因型相關(guān)，SNP基因型可能是一種潛在的肝癌肝移植預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)。
　　第二部分轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)相關(guān)SNP位

9、點(diǎn)在循環(huán)DNA中的進(jìn)一步篩選及驗(yàn)證
　　目的：應(yīng)用時(shí)間飛行質(zhì)譜技術(shù)對肝癌肝移植患者術(shù)前血漿循環(huán)DNA進(jìn)行SNP分型，進(jìn)一步驗(yàn)證第一部分中發(fā)現(xiàn)的SNP位點(diǎn)與腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的關(guān)系。
　　方法：選取2003年到2006年間在我院行肝癌肝移植的連續(xù)病例102例。抽提患者術(shù)前血漿循環(huán)DNA。利用美國Sequenom公司的MassARRAY系統(tǒng)對第一部分篩選出的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)相關(guān)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。PCR擴(kuò)增后使用MassARRAYNano

10、dispenser(Sequenom)將最終的分型產(chǎn)物點(diǎn)樣到一塊384孔的spectroCHIP(Sequenom)上，并用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行分析。結(jié)果由Mass ARRAY RT軟件系統(tǒng)(版本號3.0.0.4)實(shí)時(shí)讀取，并由MassARRAY Typer軟件系統(tǒng)(版本號3.4)完成基因分型分析。用haploview4.0軟件統(tǒng)計(jì)各位點(diǎn)基因型與轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的關(guān)系，篩選出轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)相關(guān)SNP位點(diǎn)。篩選的結(jié)果在另一組獨(dú)立病例(4

11、7例)中進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果：rs894151和rs12438080位點(diǎn)與肝癌肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)。單因素生存分析發(fā)現(xiàn)rs894151和rs12438080均為患者無瘤生存的預(yù)后因子(P=0.007，P=0.003)。多因素分析發(fā)現(xiàn)兩個(gè)位點(diǎn)的聯(lián)合指標(biāo)(rs894151/rs12438080)是患者無瘤生存的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)(P=0.030)。在超過米蘭標(biāo)準(zhǔn)的病例中，腫瘤大小和數(shù)目并不是患者術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測指標(biāo)(P>0.05)，而SNP聯(lián)合