血漿游離DNA在肝細(xì)胞肝癌中應(yīng)用價值的探索研究.pdf

1、目的:循環(huán)腫瘤DNA(circulation tumour DNA, ctDNA)是指位于外周循環(huán)的游離腫瘤DNA片段。這類游離核酸不僅可以展現(xiàn)出腫瘤基因的全貌，同時也可以在一定程度上間接反映出腫瘤進(jìn)展情況，異質(zhì)性以及侵襲能力。如果能夠?qū)@些腫瘤來源的ctDNA進(jìn)行檢測分析，就有可能完成無創(chuàng)性的液體活檢，從而實現(xiàn)腫瘤檢測，藥物篩選，預(yù)后評估以及實時治療和系統(tǒng)性基因組演變的監(jiān)測。目前，ctDNA的一系列定量定性分析方法，特別是隨著技術(shù)革新

2、而衍生的二代測序技術(shù)，可以更好地發(fā)現(xiàn)并鑒別腫瘤相關(guān)的基因或是表觀遺傳學(xué)改變，從而擴展臨床應(yīng)用前景。因此，主要針對肝細(xì)胞肝癌來進(jìn)行相關(guān)的循環(huán)游離DNA(circulating cfDNA)的研究，其中研究主體分為兩類:一方面，匯總目前所有的關(guān)于HCC診斷的傳統(tǒng)cfDNA檢測方式，通過薈萃分析來首次評估這些傳統(tǒng)技術(shù)對HCC的診斷價值;另一方面，通過應(yīng)用高通量測序技術(shù)，首次檢測HCC患者體內(nèi)的，攜帶有HCC特異性突變位點的循環(huán)游離腫瘤DNA，

3、以此為媒介進(jìn)行cfDNA診斷和預(yù)后效能的評估。
　　方法:在薈萃分析這部分內(nèi)容中，所有納入的文獻(xiàn)都進(jìn)行了QUADAS的指南評分，以判定納入文獻(xiàn)的質(zhì)量。分析對象（文獻(xiàn)）被有效的分為了三個亞組進(jìn)行分析，分別為:以cfDNA濃度測定為主的定量分析，以cfDNA甲基化檢測為主的定性分析，以及結(jié)合了甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)檢測的聯(lián)合分析亞組。統(tǒng)計分析軟件采用的是Stata12.0。綜合了說納入文獻(xiàn)的相關(guān)數(shù)據(jù)，

4、并匯總分析了聚合的敏感性，特異性，陽性擬然比(Positive likelihood ratios，PLRs)，陰性擬然比(Negativelikelihood ratios，NLRs)，診斷比值比(Diagnostic odds ratios，DORs)以及相對應(yīng)的95％的置信區(qū)間（95％ confidence intervals，95％CIs）。數(shù)據(jù)聚合的方式采用的是雙邊線性混合模型。此外，匯總的受試者工作曲線(Summary re

5、ceiver operating characteristics，SROCs)和相對應(yīng)的曲線下面積(Area under the curves，AUC)也被用來執(zhí)行分析該項技術(shù)的診斷效能。也單獨的針對異質(zhì)性和發(fā)表偏倚進(jìn)行了相關(guān)分析。在研究性論文部分，利用了MiSeqTM測序平臺，對納入研究的HCC患者的血漿和匹配的腫瘤組織進(jìn)行了高通量的測序，測序目標(biāo)為已被證實的且具有較常見突變位點的TERT, CTNNB1，and TP53基因。隨后也

6、對這些血漿中和腫瘤組織中的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了比對分析，并評估這項檢測技術(shù)與受試對象的臨床病理資料和預(yù)后生存之間的關(guān)聯(lián)性。
　　結(jié)果:在薈萃分析中，總共有包括1280名HCC患者在內(nèi)的2424名患者被納入研究，總研究數(shù)量為22例。定量分析聚合的敏感性，特異性，陽性擬然比，陰性擬然比，診斷比值比以及相對應(yīng)的95％的置信區(qū)間分別為0.741(95％CI:0.610-0.840)，0.851(95％CI:0.718-0.927),4.970(

7、95％CI:2.694-9.169),0.304(95％CI:0.205-0.451),16.347(95％CI:8.250-32.388) and0.86(95％CI:0.83-0.89)。對于定量分析，聚合的敏感性，特異性，陽性擬然比，陰性擬然比，診斷比值比以及相對應(yīng)的95％的置信區(qū)間分別為0.538(95％CI:0.401-0.669),0.944(95％CI:0.889-0.972),9.545(95％CI:5.298-17.1

8、96),0.490(95％CI:0.372-0.646),19.491(95％CI:10.458-36.329) and0.87(95％CI:0.84-0.90)。當(dāng)結(jié)合了AFP以后的聯(lián)合分析亞組，聚合的敏感性，特異性，陽性擬然比，陰性擬然比，診斷比值比以及相對應(yīng)的95％的置信區(qū)間分別為0.818(95％CI:0.676-0.906)，0.960(95％CI:0.873-0.988),20.195(95％CI:5.973-68.282)

9、,0.190(95％CI:0.100-0.359),106.270(95％CI:22.317-506.055) and0.96(95％CI:0.94-0.97)。
　　而在研究論文部分，總共納入的41名受試患者，都進(jìn)行了術(shù)前的血漿游離DNA的高通量分析。在這些患者中，總共有8位患者在血漿中發(fā)現(xiàn)了HCC特異性的突變位點，其中有一位患者的基因突變，僅僅在血漿中被檢測出來。我們也同樣發(fā)現(xiàn)了，ctDNA中突變位點的檢測情況，其實和患者的腫

10、瘤血管侵犯有明顯關(guān)聯(lián)(P=0.041)，同時，也預(yù)測了患者更短的無腫瘤生存時間(P＜0.001)。也就是說，術(shù)中發(fā)現(xiàn)血管侵犯的患者，似乎更容易獲得ctDNA檢測的陽性率。而這一部分血漿中被檢測出有ctDNA突變的患者，術(shù)后腫瘤呈現(xiàn)更容易復(fù)發(fā)的態(tài)勢。此外發(fā)現(xiàn)，cfDNA的檢測和cfDNA總體的濃度之間，沒有明顯關(guān)聯(lián)性(P=0.884)。
　　結(jié)論:研究證實了，循環(huán)游離DNA的檢測對HCC的診斷而言，是有一定潛在應(yīng)用價值的。只是對于傳

11、統(tǒng)的定量和定性分析而言，結(jié)果存在較大的不穩(wěn)健性。也就是說，單獨運用cfDNA的定量和定性分析，其結(jié)果有很高比例的假陽性或假陰性的概率出現(xiàn)，這將限制傳統(tǒng)游離DNA的檢測在HCC臨床運用的價值。但是，當(dāng)結(jié)合了AFP檢測以后，相應(yīng)的診斷效能和穩(wěn)健性都獲得較大的提升。此外，高通量測序技術(shù)輔助cfDNA的檢測可以直接克服此類檢測不穩(wěn)健性的弊端，并可以獲得很多傳統(tǒng)方式不能發(fā)現(xiàn)的信息。高通量測序的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，cfDNA中腫瘤特異性突變位點的檢測適合患