南京構(gòu)樹黃化卷葉病植原體的研究及其它幾種植原體的檢測.pdf

1、植原體(phytoplasma)是一種沒有細(xì)胞壁的植物病原細(xì)菌，寄主范圍十分廣泛，侵染多種果樹、林木和花卉植物。植原體目前尚無法在體外培養(yǎng)導(dǎo)致其研究受到限制。植原體病害在我國發(fā)生很普遍，如山東、陜西、云南等地都有很多植原體病害的報(bào)道，而近年來江蘇地區(qū)卻鮮有這方面的研究。本研究對(duì)南京部分地區(qū)的疑似植原體病害進(jìn)行了檢測和鑒定，對(duì)其中導(dǎo)致構(gòu)樹黃化卷葉病的植原體進(jìn)行了較詳細(xì)的研究，包括植原體對(duì)寄主的抗氧化相關(guān)酶的影響、致病相關(guān)的TENGU基因、

2、抗原膜蛋白的表達(dá)、分泌系統(tǒng)等，為進(jìn)一步了解植原體與寄主的相互作用，從分子水平揭示植原體的致病機(jī)理提供重要依據(jù)。本研究首次發(fā)現(xiàn)16S rI組植原體侵染構(gòu)樹造成構(gòu)樹葉片黃化、卷葉、畸形等癥狀，植原體侵染造成的桑樹白化、凌霄白化、三角槭黃化病也是國內(nèi)首次報(bào)道。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)構(gòu)樹黃化卷葉病等植原體的鑒定:用植原體16S rDNA、核糖體蛋白基因（rp）和轉(zhuǎn)錄延伸因子基因（tuf)的通用引物對(duì)疑似植原體感染的構(gòu)樹總DNA進(jìn)行

3、直接PCR和巢式PCR擴(kuò)增并測序驗(yàn)證。結(jié)果表明，構(gòu)樹葉片黃化卷葉癥狀與植原體感染有關(guān)，該植原體上述特定的基因序列與16S rI-B組中翠菊黃化菌株AY-27(HM467127.1)的相關(guān)序列高度同源，命名為構(gòu)樹黃化卷葉病(NJBP)植原體。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)由植原體引起的三角槭黃化病、桑樹白化病、凌霄白化病和國槐叢枝病等，經(jīng)鑒定，桑樹白化、凌霄白化和國槐叢枝植原體屬于16S rV組，而三角槭黃化植原體屬于16S rI組。
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4、)構(gòu)樹黃化卷葉病植原體TENGU基因功能的初步研究:通過PCR擴(kuò)增從構(gòu)樹黃化卷葉病植原體中克隆到TENGU基因，將該基因連接到pCAMBIA1302植物表達(dá)載體上構(gòu)建重組表達(dá)載體pCAMBIA1302-TENGU，應(yīng)用蘸花法將該重組載體轉(zhuǎn)染擬南芥。結(jié)果含TENGU基因的pCAMBIA1302重組載體通過農(nóng)桿菌GV3101轉(zhuǎn)染到擬南芥基因組中并成功表達(dá)，得到的轉(zhuǎn)基因擬南芥表現(xiàn)為矮化或叢枝癥狀，證明構(gòu)樹黃化卷葉病植原體的TENGU基因與寄主

5、的表型癥狀相關(guān)。
　　(3)構(gòu)樹黃化卷葉病植原體sec分泌系統(tǒng)3個(gè)亞基的克隆及其生物信息學(xué)分析:采用PCR方法擴(kuò)增了構(gòu)樹黃化卷葉病植原體sec分泌系統(tǒng)的3個(gè)亞基secA、secY和secE的基因，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。secA、secY和secE基因全長分別為2508bp，1358 bp和450 bp，分別編碼835個(gè)、413個(gè)、136個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。SecA為親水性蛋白，secY和secE均為疏水性蛋白質(zhì)，且在這3個(gè)蛋白的二

6、級(jí)結(jié)構(gòu)中，α螺旋結(jié)構(gòu)所占比重最高。構(gòu)建的三維結(jié)構(gòu)中，secA和secY符合立體化學(xué)規(guī)則;secE三維結(jié)構(gòu)可靠性分析小于30％，未能建模成功。對(duì)這些亞基的親疏水性及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析，為進(jìn)一步在分子水平上研究構(gòu)樹黃化卷葉病植原體的毒力因子及其分泌方式奠定基礎(chǔ)。
　　(4)構(gòu)樹黃化卷葉病植原體抗原膜蛋白Amp基因的原核表達(dá):為研究構(gòu)樹黃化卷葉病植原體Amp蛋白的功能，應(yīng)用PCR擴(kuò)增到抗原膜蛋白Amp基因，將該基因片段純化后與pET-28

7、a(+)載體相連接并體外原核表達(dá)。結(jié)果成功克隆了構(gòu)樹黃化卷葉病植原體的抗原膜蛋白Amp基因，但是該基因全長卻無法在大腸桿菌中表達(dá)。由于Amp基因是由3個(gè)部分組成，包括N端輸出序列、中間親水域和C端跨膜區(qū)域，分別將切去N端信號(hào)肽的剩余部分和切除兩端后的剩余部分進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這兩段可以在大腸桿菌中很好的表達(dá)，純化后的這些表達(dá)產(chǎn)物可用于進(jìn)一步研究抗原膜蛋白的功能。
　　(5)感染植原體的構(gòu)樹抗氧化相關(guān)酶活的變化:植物受病原菌感染后通常會(huì)

8、產(chǎn)生一系列抗氧化相關(guān)的防御反應(yīng)，為了解構(gòu)樹感染植原體后抗氧化相關(guān)的防御反應(yīng)，本研究比較了感病構(gòu)樹和健康構(gòu)樹葉片的多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)活性以及丙二醛(MDA)含量隨月份的變化。結(jié)果表明，在相同的生長季節(jié)(4～9月)，染病構(gòu)樹的PPO、POD、SOD酶活及MDA含量均大于健康構(gòu)樹，而在10月份，POD、SOD酶活及MDA含量卻表現(xiàn)出相反的情況;CAT的變化趨勢(shì)與POD酶活