泡桐叢枝病植原體延伸因子tuf基因分析及其他寄主植物的檢測.pdf

1、論文包括泡桐叢枝病植原體南陽分離物(PaWB)延伸因子(EF-TU)基因tuf的研究、泡桐叢枝病田間寄主的檢測和鑒定及其他兩種植物病害的植原體檢測三方面研究內(nèi)容。 根據(jù)GenBank中已登錄的植原體延伸因子tuf基因的保守核苷酸序列設(shè)計(jì)特異引物,擴(kuò)增得到泡桐叢枝病植原體(PaWB)南陽分離物的tuf基因,核苷酸長度1185bp,編碼394個(gè)氨基酸的完整蛋白序列,大小約為43 kDa。利用蛋白分析軟件TMHMM 2.0和PROST

2、 II預(yù)測此植原體tuf為非跨膜蛋白且定位于植原體細(xì)胞質(zhì)中。將PaWB tuf基因連接到pGEX-4T-3表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)出分子量約62 kDa含有GST標(biāo)簽的融合蛋白。用該融合蛋白免疫德國大白兔獲得了特異性較高的抗血清。用不同的方法對泡桐叢枝病株制備的抗原進(jìn)行ELISA和Dot blotting的結(jié)果進(jìn)一步顯示了tuf蛋白具有與膜結(jié)合的特性,對提取抗原的凍融處理是獲得理想ELISA結(jié)果的重要前提條件。Wes

3、tern blot和間接免疫熒光分析表明,該抗血清分別與PaWB、PeV和CWB植原體抗原產(chǎn)生特異免疫反應(yīng),而與相應(yīng)的健康植株對照及JWB、BWB植原體抗原無免疫反應(yīng)。 用分子生物學(xué)的方法對泡桐叢枝病原的其他寄主進(jìn)行了檢測和鑒定。依據(jù)植原體16S rRNA基因設(shè)計(jì)的通用引物,采用巢式PCR檢測了從泡桐叢枝病樹附近采集的不同植物上的30份樣品。從其中8種植物中擴(kuò)增到長為1246bp的片段,序列分析表明它們都屬于16SrI-D亞組,

4、與泡桐叢枝病植原體的同源性最高,初步推斷這8種植物是泡桐叢枝病的其他寄主。其中牛筋草(Eleusine indica)、狗尾草(Setaria viridis)、山藥(Dioscoreaopppsita)、燈籠泡(Physalis angulata)、南瓜(Cucurbita moschata)、楸樹(Catalpa bungei)6種植物是首次報(bào)到植原體病害；并且從辣椒(Capsicum annuum)和花生(Arachis hypo

5、gaea)中檢測到的植原體與以往文獻(xiàn)報(bào)道的辣椒僵頂病及花生從枝病病原植原體不同。本研究還在楸樹葉片黃化(CbY)樣品中擴(kuò)增到了植原體的tuf基因,其序列同源性也與泡桐叢枝病植原體最高。DAPI熒光顯微鏡和間接免疫熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明,楸樹黃化植原體與PaWB-NY tuf抗血清產(chǎn)生特異免疫反應(yīng),并且楸樹黃葉組織中的植原體含量明顯低于泡桐叢枝病組織。 從河北承德采集表現(xiàn)異常的丁香黃葉和北京采集到的黃金槐短枝樣品中,通過巢式PCR

6、擴(kuò)增到了植原體16S rRNA基因,克隆測序,得到了長度為1246bp的核苷酸序列,初步證明了采集樣品中含有植原體。序列分析和RFLP分析顯示黃金槐短枝(SclS)植原體屬于16SrⅠ-D亞組。丁香黃化(SoY)植株上植原體與豬屎豆叢枝植原體同源性最高,屬于16SrⅡ-A亞組,與報(bào)道的引起紫丁香叢枝病的病原不同。在丁香簇葉樣品(SoP)中檢測到兩種植原體,分別屬于16SrⅠ-D亞組和16SrⅡ-A亞組,推斷可能是這兩種植原體的復(fù)合侵染。