南京幾種植原體病害的鑒定及銅錢樹叢枝病植原體致病機(jī)理的初步研究.pdf

1、植原體原稱類菌原體(MLO)，屬原核生物界柔膜菌綱，專性寄生于植物韌皮部的篩管細(xì)胞，主要通過取食植物韌皮部汁液的昆蟲傳播，難以進(jìn)行人工體外培養(yǎng)。故傳統(tǒng)上依賴于微生物表型特征與生理生化特性等的分類方法難以應(yīng)用到植原體中，使得其檢測及分類多依賴于分子生物學(xué)手段。利用高度保守基因16SrDNA進(jìn)行PCR檢測分析是目前國際上用于植原體分類研究的主要方法，基于該基因序列的PCR測序分析與PCR-RFLP分析已經(jīng)作為植原體初步分類體系被廣泛接受并應(yīng)

2、用。隨后，相對不及16S rDNA保守的基因，如rp、tuf、 secA、secY等基因也逐漸被應(yīng)用于親緣關(guān)系較近的植原體亞組和株系之間的分類研究中。本文主要基于以上基因并利用分子生物學(xué)手段對南京部分地區(qū)幾種疑似植原體病害的病原進(jìn)行了分子檢測與鑒定，為進(jìn)一步研究病害的發(fā)生規(guī)律、傳播特點(diǎn)及綜合防治等提供了理論基礎(chǔ)。
　　本研究首先利用DAPI染色方法初步觀察植原體在植物體內(nèi)的分布特點(diǎn)，在患病的二月藍(lán)植株嫩莖韌皮部附近觀察到特異性的熒

3、光亮點(diǎn);又分別利用植原體的16S rDNA、rp基因、tuf基因及secY基因的通用引物對病株二月藍(lán)的總DNA進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，均獲得與目的基因大小一致的特異性片段，測序后比對分析與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析結(jié)果均表明:患病二月藍(lán)中的植原體與16SrV-B亞組成員親緣關(guān)系較近，可以聚為一簇，屬于16SrV-B亞組成員，該結(jié)果與其16S rDNA的虛擬RFLP分析結(jié)果一致。其次，分別利用植原體的16S rDNA、rp基因的通用引物與設(shè)計(jì)的secA基

4、因的引物對病株銅錢樹的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均獲得與目的基因大小一致的特異性片段，測序后比對分析與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析結(jié)果表明:患病銅錢樹中的植原體也與16SrV-B亞組成員聚為一小進(jìn)化分枝，屬于16SrV-B亞組成員，且與該植原體16S rDNA的虛擬RFLP分析結(jié)果一致。最后，利用植原體的16S rDNA的通用引物對患病的棕櫚、桃樹、矮牽牛、竹、玉簪這5種植物的總DNA分別進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，均得到約1.2 kb大小的特異性目的條帶，測

5、序后比對分析、虛擬RFLP分析及基于它們的16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析結(jié)果均表明，這5種植物中的植原體均與16SrV組成員之間親緣關(guān)系較近，可以聚為一大進(jìn)化分枝，初步確定它們同屬于16SrV組成員，并暫時(shí)將它們劃分為不同的植原體株系。另外，本研究還基于目前全球已經(jīng)報(bào)道的16SrV組植原體數(shù)據(jù)，利用Maxent生態(tài)位模型和ArcGIS軟件對16SrV組植原體在南京的潛在分布情況進(jìn)行預(yù)測，同時(shí)結(jié)合實(shí)際調(diào)查及檢測結(jié)果進(jìn)行分析，表明南京

6、的中部與北部地區(qū)屬于該類病害發(fā)生的中風(fēng)險(xiǎn)區(qū)，而南京南部地區(qū)鄰近高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)，更適于該類病害的分布。
　　植原體的致病機(jī)理研究對植原體的防治具有極其重要的意義。在病害的發(fā)生和發(fā)展過程中，植物體內(nèi)酶的活性及某些代謝物的含量變化在一定程度上反應(yīng)了寄主與病原物的互作關(guān)系，它們參與植物的抗逆性反應(yīng)，有助于從生理生化方面理解植原體的致病機(jī)理。植物中的過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、抗壞血

7、酸過氧化物酶(APX)、超氧化物歧化酶(SOD)等與植物的抗氧化作用及防御反應(yīng)密切相關(guān)。通過測定不同生長期健康與患病銅錢樹葉片中上述6種酶活性以及丙二醛(MDA)、可溶性總糖和可溶性蛋白質(zhì)的含量變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染植原體的銅錢樹中上述6種酶活性以及丙二醛與可溶性糖含量較健康植株均呈現(xiàn)不同程度的升高趨勢，可溶性蛋白質(zhì)含量則較健康植株減少;除PPO活性變化不明顯外，其它酶的活性及代謝物的含量隨著植物生長時(shí)期的不同也表現(xiàn)出不同程度的變化，往往隨

8、著植原體的生長及繁殖活動(dòng)程度增加即植物患病程度加劇其變化程度表現(xiàn)較為顯著。
　　胸苷酸激酶(TMK)可以催化磷酰基團(tuán)從ATP轉(zhuǎn)移到dTMP形成dTDP，是植原體DNA合成時(shí)形成dTTP補(bǔ)救途徑中的關(guān)鍵酶，對植原體的生存必不可缺。本研究對16SrV-B亞組中的銅錢樹叢枝病植原體的胸苷酸激酶基因進(jìn)行了克隆、原核表達(dá)及酶活性測定分析。經(jīng)克隆測序后比對結(jié)果顯示:該植原體的胸苷酸激酶核苷酸序列與JWB植原體的完全一致。將該胸苷酸激酶與已報(bào)道

9、的植原體胸苷酸激酶的氨基酸序列比對分析顯示:PahWB植原體TMK的氨基酸序列與OY植原體TMK-a、WBD植原體TMK-1、PaWB植原體TMK-a-1及PaWB植原體TMK-a-2的氨基酸序列相似性較高，而與OY植原體TMK-b、WBD植原體TMK-2、PaWB植原體TMK-b的氨基酸序列相似性較低。該胸苷酸激酶在大腸桿菌中成功完成表達(dá)，純化后獲得純度較高的大小約28 kDa的融合目的蛋白，但經(jīng)雙酶分析法測定結(jié)果表明該酶幾乎沒有活性