棗瘋病植原體的分子檢測及鑒定.pdf

1、棗樹原產(chǎn)我國，屬于我國的特產(chǎn)果樹。近年來，我國棗樹的栽培面積不斷擴大，使得棗產(chǎn)業(yè)在新疆果業(yè)中占有一定分量。然而，在生產(chǎn)上對棗樹及果品影響的因素有很多，其中棗瘋病是棗產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要限制因素。棗瘋病被稱為棗樹的癌癥，具有毀滅性，目前雖然出現(xiàn)一些治愈方法，但是其效果不太明顯。本文基于以往的研究基礎(chǔ)，根據(jù)Lee設(shè)計的通用引物R16mF1/R16mR1對植原體16S rDNA進行PCR擴增，獲得其目的片段，通過BLAST比對，DNAman 軟件分

2、析，根據(jù)保守區(qū)域設(shè)計多對引物，通過實驗篩選適合的引物，優(yōu)化PCR擴增體系及條件，建立了棗瘋病植原體的檢測體系。利用該檢測體系，對新疆部分主栽品種進行帶病情況調(diào)查。具體研究的內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　 1．根據(jù)植原體16S rDNA通用引物R16mF1/R16mR1，對陜西和山西具有棗瘋病植株的總DNA進行PCR擴增及測序，分別得到1432bp和1433bp的兩條序列，DNAman分析比對結(jié)果表明二者同源性為99.37%。挑選27條關(guān)

3、于16S rDNA具有明確分組的植原體序列，進行同源性分析，以此為基礎(chǔ)，選擇17種具有16S rDNA分組的典型的限制性內(nèi)切酶，通過pDRAW32軟件計算機模擬RFLP，結(jié)果表明棗瘋病植原體的酶切圖譜都一致，與其他組的酶切圖譜均存在差異，其中最大的為9處差異，最小的為3處差異。分析同源性并繪制系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明來自陜西和山西的棗瘋病植原體的16S rDNA片段和16S rDNA V-B組的遺傳距離最近，應(yīng)該劃分到16S rDNA V-

4、B組中。故確定棗瘋病植原體16S rDNA屬于16S rDNA V-B。
　　 2．對獲得的16S rDNA序列，通過BLAST獲得與其相似的序列99條，DNAman軟件分析其同源性，得到棗瘋病植原體的保守序列，運用Primer 5.0針對保守序列設(shè)計引物，運用BLAST檢測這些引物，是否只擴增植原體16S rDNA，剔除可以擴增出其他菌體的引物序列，篩選出只擴增植原體序列的NTF1/NTR1、NTF2/ NTR1、NTF3/N

5、TR1、NTF1/NTR2、NTF2/NTR2和NTF3/NTR2六對引物序列，確保實驗不出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。通過實驗進一步篩選，挑出適宜的PCR檢測體系的引物NTF1/ NTR1、NTF1/NTR2、NTF2/NTR2、NTF3/NTR2四對，克隆測序檢測擴增片段，證明所檢測到的植原體均符合預(yù)測結(jié)果，并均屬于棗瘋病植原體的16S rDNA片段，保證實驗的準(zhǔn)確性。通過對棗瘋病植原體總DNA稀釋10-50倍，發(fā)現(xiàn)總DNA濃度在該范圍內(nèi)對該檢測

6、體系幾乎沒有影響，說明檢測的靈敏性比較好，可以很好地用于棗瘋病植原體的檢測。
　　 3．利用建立起來的棗瘋病植原體PCR檢測體系，對在新疆采集的梨棗，灰棗，金絲小棗，冬棗和駿棗等樣品進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在喀什地區(qū)采集的有棗瘋病癥狀的駿棗樣品中存在有植原體，在庫爾勒地區(qū)采集的無棗瘋病癥狀的部分駿棗和脆棗樣品中也被檢測出有植原體存在。因此，要求我們必須對新疆棗瘋病病情進行深入的調(diào)研，搞清疆內(nèi)棗樹攜帶植原體的情況，確保棗樹產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。