博萊霉素大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞表型與肺纖維化相關性研究.pdf

1、目的：
　　血管內(nèi)皮細胞（endothelial cell,EC）作為血管壁基本的結構和功能單位，是血管屏障重要的組成部分，生理狀態(tài)下在調(diào)節(jié)血管內(nèi)外物質(zhì)交換、維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中起著關鍵作用。在損傷因子的作用下，通過一系列調(diào)控機制，EC即可發(fā)生應激反應以消除致病因子對機體的損傷作用，與此同時，EC通過表型轉(zhuǎn)變參與損傷組織的修復，如炎癥所致的基底膜損傷或斷裂的重建。一旦其調(diào)節(jié)機制發(fā)生異常，則導致形態(tài)和功能的改變，并可能成為各種疾病發(fā)生

2、的主要啟動因素之一。肺急性損傷的發(fā)病過程包括急性肺泡炎期和損傷組織修復重塑階段，而血管反應是炎癥發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，其中EC緊密連接開放、血管通透性增高是炎癥反應的主要表現(xiàn)形式，它不僅為清除損傷因子及壞死組織提供了必要的物質(zhì)基礎，而且為損傷組織的重建提供了保證。隨著組織修復的完成，肺微血管內(nèi)皮細胞（pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs）的功能恢復正常。但是我們前期研究顯示，博萊霉素

3、（bleomycin,BLM）損傷大鼠PMVECs間緊密連接(tight junction,TJ)卻持續(xù)開放，即使肺間質(zhì)基質(zhì)已過度沉積，PMVECs的TJ仍未能恢復正常。這種內(nèi)皮屏障功能的異常為纖維化發(fā)生時單核細胞游出并釋放各種致纖維化生長因子提供了途徑。在PF發(fā)生過程中，成纖維細胞（fibroblast,Fb）轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞（myofibroblast,MFb）是關鍵的細胞事件之一。在Fb轉(zhuǎn)化的過程中，細胞因子及其形成的網(wǎng)絡起著重

4、要的作用。我們的前期研究表明，不同致病因子均可引起幾乎相同的細胞因子的表達上調(diào)，而且在致纖維化過程中起著重要作用的細胞因子，如TGF-β1、CTGF、IGF等在正常生理代謝中亦有表達，提示相關的細胞因子不僅在致纖維化中有異常表達，而且是細胞正常生理代謝中不可或缺的調(diào)控因素。已經(jīng)證實，細胞因子的表達與細胞的功能密切相關，如作為血細胞主要成分之一的單核細胞并不具備分泌細胞因子的功能，但當其游走至組織間或肺泡時則轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂袕姶蠓置诠δ艿木奘杉?/p>

5、胞。單核細胞表型的轉(zhuǎn)變在抗組織損傷中起著重要作用。EC是分泌CTGF的細胞之一，它具有促進Fb轉(zhuǎn)化為MFb的作用。在損傷因子作用下，EC間TJ開放意味著其形態(tài)和功能已發(fā)生明確改變，但是BLM損傷大鼠肺EC間的TJ持續(xù)開放似提示PMVECs表型轉(zhuǎn)變的調(diào)控機制發(fā)生紊亂。在此基礎上，表型發(fā)生改變的PMVECs分泌CTGF的功能是否發(fā)生異常，并成為PF形成的主要誘發(fā)因素之一，目前未見報告。本實驗通過光鏡、電鏡、ELISA檢測法及免疫組織化學染色

6、等方法，觀察肺炎及PF大鼠肺組織的病理過程及PMVECs形態(tài)學改變，比較兩組血清CTGF的含量及時相變化趨勢和兩組大鼠肺組織MVECs的CTGF表達情況，分析BLM損傷大鼠PMVECs形態(tài)、功能的改變與CTGF表達的關系，以探討PMVECs表型與PF發(fā)生的關系。
　　方法：
　　SD大鼠45只，體重150±20g，雌雄不拘（第四軍醫(yī)大學實驗動物中心）。隨機分為3組，即BLM組、肺炎鏈球菌組、正常組，每組15只。BLM組用博萊

7、霉素-A5的溶液（天津太河制藥有限公司出品，8mg/支，批號040902）用生理鹽水配成4g/L溶液，按5mg/kg給藥注入氣管。注入過程中將大鼠直立、旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)分布充分、均勻。肺炎組在相同條件下向氣管內(nèi)注入肺炎鏈球菌菌液0.15mL/只（中國藥品生物制品檢定所出品，細菌號31003，復蘇繁殖2代，稀釋成菌液，菌落數(shù)3×108/mL）。正常組在相同條件下向氣管內(nèi)注入0.25mL的生理鹽水，方法同上。分別于給藥后第3，7，14，2

8、1和28d處死大鼠，經(jīng)右室流出道用生理鹽水沖洗致大鼠肺發(fā)白后，取肺組織用10g/L多聚甲醛固定后石蠟包埋、切片，HE、VG染色；取少量各組肺組織用3％的戊二醛固定后制作成電鏡標本，觀察PMVECs形態(tài)學改變。ELISA法檢測各組血清CTGF含量及其時相變化趨勢。免疫組織化學染色采用兩步法檢測觀察對比各組大鼠肺間質(zhì)中CTGF在PMVECs中的表達情況。
　　結果：
　　1、肺炎與BLM組光鏡觀察：肺炎組第3d肺間質(zhì)內(nèi)見大量炎細

9、胞，肺泡腔結構消失呈片狀實變區(qū)，第14d肺通氣基本恢復正常；BLM組第3d肺泡腔滲出性改變，肺泡間隔炎細胞浸潤，第14d、21d肺泡間隔增厚明顯，實變區(qū)明顯增多，間質(zhì)Fb增多，第28d肺泡間隔增厚，可見大量膠原纖維。
　　2、PMVECs超微結構觀察：肺炎組第7d PMVECs呈增生狀態(tài)，緊密連接開放，胞質(zhì)厚度增加，吞飲小泡明顯減少，之后恢復正常；BLM組PMVECs表面不光整，表面可見指狀突起及血小板粘附，體積增大呈增生狀態(tài)，第

10、7、14、21d細胞內(nèi)吞飲小泡明顯持續(xù)增多，且緊密連接持續(xù)開放，第28d PMVECs旁大量膠原沉積。
　　3、血清CTGF測定：肺炎組第3d增高，第7d驟降，之后恢復正常（12.06±0.43pg/mL）；BLM組第7d開始增高，第21d增至高峰(19.45±0.41pg/mL)，組間差異明顯（n=15, p<0.05），兩組比較差異具有統(tǒng)計學意義。
　　4、免疫組化染色：BLM組第21d大鼠肺組織CTGF陽性表達較肺炎組

11、第21d明顯增高，肺間質(zhì)MVECs的CTGF陽性表達明顯（n=15，p<0.05），兩組比較差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結論：
　　1、BLM可致大鼠PMVECs形態(tài)改變及功能紊亂，PMVECs表型轉(zhuǎn)變是CTGF時相和量異常表達的關鍵因素之一，它可能是BLM所致PF發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。
　　2、基于PMVECs由“屏障表型”轉(zhuǎn)變?yōu)椤笆湛s”表型與EC代謝密切相關，[Ca2+]i代謝調(diào)節(jié)功能紊亂可能是EC表型轉(zhuǎn)變及EC異常分