乳香—沒藥藥對(duì)抗炎活性與物質(zhì)基礎(chǔ)研究.pdf

1、本論文研究工作為“國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目－乳香－沒藥對(duì)藥協(xié)同增效及其分子機(jī)制研究”的部分研究內(nèi)容。
　　第一章本論文對(duì)芳香類藥用植物的抗炎鎮(zhèn)痛活性成分及其作用機(jī)制進(jìn)行歸納總結(jié)，發(fā)現(xiàn)其抗炎鎮(zhèn)痛活性成分主要包括揮發(fā)油類、苯丙素類、黃酮類、三萜類、生物堿類、有機(jī)酸類等化合物；其抗炎鎮(zhèn)痛作用機(jī)制主要與抑制炎性介質(zhì)的釋放、作用于阿片受體、抑制腎上腺素的合成、調(diào)節(jié)NO的合成水平有關(guān)。為開展實(shí)驗(yàn)研究工作提供理論依據(jù)。
　　論文對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)

2、炎(RA)的發(fā)病機(jī)理、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型、中藥治療現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。為開展試驗(yàn)研究提供依據(jù)與參考。
　　第二章采用佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠(AA)模型對(duì)乳香－沒藥藥對(duì)配伍前后抗炎效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：乳香、沒藥、藥對(duì)水提醇沉上清液高低劑量組均能顯著抑制AA大鼠血漿和足跖腫脹組織中NO、IL－2、PGE2、TNFα的生成(P<0.001)，顯著抑制腫脹組織中MDA的生成(P<0.001)，顯著抑制AA大鼠足跖腫脹程度(P<0.001)；藥對(duì)低劑

3、量組抑制AA大鼠血漿中PGE2、TNFα生成的作用較單味藥優(yōu)，抑制腫脹組織中MDA、PGE2生成的作用也較單味藥優(yōu)，提示兩藥配伍后抗炎活性增強(qiáng)。
　　第三章對(duì)乳香－沒藥配伍前后體外抗炎活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。采用原代巨噬細(xì)胞模型、體外抗氧化實(shí)驗(yàn)、體外抗凝血實(shí)驗(yàn)對(duì)乳香－沒藥及其效應(yīng)部位的生物效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。研究結(jié)果分述如下：
　　1、巨噬細(xì)胞分泌NO的研究表明：與乳香、沒藥水煎液相比，藥對(duì)水煎液抑制NO釋放的活性增強(qiáng)，其IC50分別為16

4、5.77、25.38、7.66μg/mL，提示兩藥配伍存在一定的協(xié)同增效作用；配伍后藥對(duì)水提醇沉上清液經(jīng)大孔吸附樹脂(型號(hào)：101)洗脫的40％乙醇洗部位抑制NO釋放活性較各單味藥物增強(qiáng)，其IC50為0.0102μg/mL，提示兩藥配伍存在明顯的協(xié)同增效作用；配伍后藥對(duì)80％醇洗部位抑制NO釋放活性(IC50為0.827μg/mL)優(yōu)于乳香，弱于沒藥(IC50為0.16μg/mL)；藥對(duì)95％醇洗部位抑制NO釋放的IC50為0.0049

5、4μg/mL，與其他部位比較活性為最強(qiáng)。與單體3－羰基甘遂－8，24－二烯－21－羧酸、3－乙?；趸仕欤?，24－二烯－21－羧酸、α－香樹素相比，單體2－甲氧基－8，12－環(huán)氧－吉瑪－1(10)，7，11－三烯－6－酮、2－甲氧基－5－乙酰氧基－呋喃－吉瑪－1(10)－烯－6－酮的活性較顯著，IC50分別為：0.0729、0.0895μg/mL。
　　2、抗氧化實(shí)驗(yàn)表明：乳香、沒藥、藥對(duì)水提醇沉上清部位清除DPPH自由基的I

6、C50分別為166.4、73.365、89.815μg/mL；配伍后藥對(duì)40％醇洗部位清除DPPH自由基活性較乳香、沒藥各單味藥物增強(qiáng)，其IC50分別為31.228、47.346、67.726μg/mL，提示兩藥配伍存在一定的協(xié)同增效作用；沒藥80％醇洗部位清除自由基的活性較藥對(duì)配伍后的活性強(qiáng)，其IC50分別為81.34、190.60μg/mL。
　　3、抗凝血實(shí)驗(yàn)表明：乳香、沒藥、藥對(duì)水煎液抑制凝血酶活性的IC50分別為0.00

7、367、0.00435、0.00315 mg/mL，乳香、沒藥、藥對(duì)水提醇沉上清部位抑制凝血酶活性的IC50分別為0.0161、0.0980、0.00103 mg/mL，乳香、沒藥、藥對(duì)80％醇洗部位抑制凝血酶活性的IC50分別為0.041、0.049、0.0092 mg/mL，提示兩藥配伍存在一定的協(xié)同增效作用；單體2－甲氧基－8，12－環(huán)氧－吉瑪－1(10)，7，11－三烯－6－酮、2－甲氧基－5－乙酰氧基－呋喃－吉瑪－1(10)－

8、烯－6－酮、3－乙?；趸仕欤?，24－二烯－21－羧酸、3－羰基甘遂－8，24－二烯－21－羧酸、α－香樹素、α及β-乙酰乳香酸混合物抗凝血活性的IC50分別為0.0061、0.071、0.001、0.0011、0.0038、0.0023 mg/mL。
　　第四章對(duì)乳香－沒藥的效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行研究。
　　1.采用UPLC/Q－TOFMS聯(lián)用技術(shù)結(jié)合MarkerLynx4.1軟件分析乳香－沒藥藥對(duì)合并液與合煎液之間化學(xué)成分

9、的差異，研究結(jié)果表明：兩者合煎后五環(huán)三萜類化合物(α-乳香酸、β-乳香酸)、四環(huán)三萜類化合物(欖香酮酸、3－羥基甘遂烷－7，24－二烯－21－酸、3－羰基甘遂烷－8，24－二烯－21－酸)溶出量顯著增加。
　　2.采用UPLC/Q－TOFMS聯(lián)用技術(shù)分析乳香－沒藥效應(yīng)部位中的化學(xué)成分，結(jié)果表明：從抗炎活性部位藥對(duì)水提醇沉上清液的80％醇洗部位中鑒定出了7個(gè)化學(xué)成分，主要包括大環(huán)二萜、四環(huán)三萜、甾類化合物；從抗炎活性部位藥對(duì)95％醇

10、洗部位中鑒定出了12個(gè)化學(xué)成分，主要包括倍半萜、四環(huán)三萜酸、五環(huán)三萜、五環(huán)三萜酸類化合物；從抗炎活性部位藥對(duì)40％醇洗部位中鑒定出了1個(gè)化學(xué)成分，為倍半萜類化合物。
　　3.采用硅膠柱層析的方法對(duì)乳香.沒藥藥對(duì)水煎液的80％醇沉上清液的乙酸乙酯部位進(jìn)行分離和純化，從該部位分離得到3個(gè)化合物，通過TLC、1HNMR、13CNMR鑒定，分別為：3－羥基甘遂－8，24－二烯－21－羧酸(RM－175)、3－乙?；趸仕欤?，24－二烯

11、－21－羧酸(RM－144)、3－羰基甘遂－8，24－二烯－21－羧酸(RM－214)。
　　4、采用UPLC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)分析鑒定乳香.沒藥配伍前后湯液中的化學(xué)成分組成，采用逐步回歸分析方法對(duì)湯液的理化參數(shù)與化學(xué)成分的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果表明：湯液中五環(huán)三萜酸酯類化合物與湯液的濁度呈顯著正相關(guān)，倍半萜類化合物與湯液的黏度呈顯著負(fù)相關(guān)。
　　第五章基于UPLC/Q-TOFMS的佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)模型大鼠血漿和尿液代謝

12、輪廓分析及乳香－沒藥的干預(yù)作用。
　　1、血漿代謝輪廓分析：血漿代謝譜PCA分析結(jié)果表明正常大鼠與AA模型大鼠得到明顯區(qū)分，說明AA模型大鼠機(jī)體代謝存在差異。經(jīng)OPLS－DA分析的S－plot，尋找潛在的生物標(biāo)志物。通過HMDB數(shù)據(jù)庫檢索，并參照文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，初步鑒定出14個(gè)具有顯著分類意義的特征性生物標(biāo)志物，其中6個(gè)表現(xiàn)為上調(diào)，8個(gè)表現(xiàn)為下調(diào)。乳香、沒藥、藥對(duì)水提醇沉上清液干預(yù)后，對(duì)AA模型大鼠所致的代謝輪廓變化具有較好的回調(diào)作用。

13、其中對(duì)7個(gè)生物標(biāo)志物(LysoPC(17:0)，LysoPC(15:0)，LysoPE(20:2(11Z，14Z)/0:0)，LysoPE(20:1(11Z)/0:0)，LysoPE(18:1(9Z)/0:0)，LysoPC(18:2(9Z，12Z))，LysoPC(16:0/0:0))具有上調(diào)的作用；對(duì)3個(gè)生物標(biāo)志物(丙氨酰色氨酸、反十八烯亞油酸、二十二碳六烯酸)具有下調(diào)的作用，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2、尿液代謝輪廓分析：尿液

14、代謝譜PCA分析結(jié)果表明正常大鼠與AA模型大鼠得到明顯區(qū)分，說明AA模型大鼠機(jī)體代謝存在差異。經(jīng)OPLS-DA分析的S－plot，尋找潛在的生物標(biāo)志物。通過HMDB數(shù)據(jù)庫檢索，并參照文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，初步鑒定出13個(gè)具有顯著分類意義的特征性生物標(biāo)志物，其中2個(gè)表現(xiàn)為上調(diào)，10個(gè)表現(xiàn)為下調(diào)。乳香、沒藥、藥對(duì)水煎液的醇沉上清液干預(yù)后，對(duì)AA模型大鼠所致的代謝輪廓變化具有較好的回調(diào)作用。其中對(duì)10個(gè)生物標(biāo)志物(4，6－二氫喹啉、丙二酰肉堿、N，N－二