克羅恩病β-防御素-2基因多態(tài)性及其轉錄活性的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、研究背景和目的: 克羅恩病是炎癥性腸病的一個主要類型,表現為胃腸道的慢性、反復發(fā)作性和非特異性的全腸壁炎,病變呈節(jié)段性分布,可發(fā)生于胃腸道的任何部位,但好發(fā)于回腸、結腸(包括回盲部)和肛周。臨床表現為反復發(fā)作的右下腹痛和臍周痛,可伴有腹瀉、腹部炎性腫塊、肛門病變及其它系統(tǒng)性癥狀。 腸道是人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分,在接觸大量的食物和消除病原微生物的過程中,腸黏膜屏障起了重大的作用。由生理性屏障結構和天然存在的抗微生物分子

2、構成的先天性免疫,是宿主腸道防御系統(tǒng)的重要組成部分。研究表明,哺乳動物小腸潘氏細胞分泌的防御素,是腸道天然免疫的重要組成部分。近年來,防御素家族在先天性防御體系中的作用日益受到關注。國外學者發(fā)現克羅恩病可能是一種防御素缺陷綜合癥,主要表現為hBD-2、hBD-3[1,2,3]的缺乏;hBD-2啟動子區(qū)基因改變亦可導致機體表達低拷貝數的hBD-2[4,5]。我們課題組在前期工作中通過免疫組化和原位雜交技術發(fā)現克羅恩病患者腸粘膜確實存在著h

3、BD-2表達量的減少。我們對hBD-2啟動子區(qū)基因測序分析發(fā)現了CD患者在-233位點有多態(tài)性改變,這個改變位點相鄰于核轉錄因子Kappa-B的結合位點,因而考慮是否上述改變影響了NF-KB與hBD-2啟動子區(qū)的結合,降低hBD-2轉錄活性和表達[5]。本研究擬在此基礎上檢測該多態(tài)位點并進行基因分型,同時構建hBD-2雙熒光素酶報告基因質粒用于防御素在CD中的功能學研究。 Ogura等[6]發(fā)現CARCD15/NOD2的三個基因

4、多態(tài)性位點R702W、G908R與3020insC與西方白種人CD呈顯著性相關。NOD2蛋白能通過自身的模式識別受體識別微生物的多種分子結構模式如細菌脂多糖和胞壁酰二肽從而激活NF-KB,誘導炎癥因子的產生,炎癥因子再正向反饋激活NF-KB,如此擴大炎癥反應。NOD2基因的突變是CD的危險因素,會導致約3%的NOD2蛋白中LRR缺失或截短,這些變異會影響其功能,使得NOD2蛋白無法激活NF-KB,從而抑制先天性防御反應。因此許多學者認為

5、NOD2蛋白是腸道細菌免疫的關鍵調節(jié)蛋白。本課題組在中國人中未發(fā)現上述3個常見的SNP,但發(fā)現可能與中國人CD相關的CARD15/NOD2多態(tài)性位點P268S改變,其基因第802位堿基由C變成T,密碼子由CCC變成UCC,編碼氨基酸由脯氨酸變成絲氨酸,發(fā)生率為10.4%,而在UC及正常人中均無陽性發(fā)現;另外,該多態(tài)性與臨床特征有一定相關性,因此,NOD2/CARD15基因的P268S改變可能是中國人CD的SNp。目前本課題組已經成功構建

6、了野生型和P268S突變型NOD2基因真核表達載體,本研究將構建人β-防御素-2雙熒光素酶報告基因載體及其克羅恩病相關突變體,與NOD2真核表達載體共轉染以研究CD的基因多態(tài)性改變對先天性免疫的影響。 LPS是革蘭氏陰性細菌的主要表面成分,是動物免疫系統(tǒng)對入侵的革蘭氏陰性菌的首要識別及攻擊目標,同時也在細菌在黏附、入侵和逃避免疫攻擊中起著重要的作用。腫瘤壞死因子-a是機體在感染、休克、創(chuàng)傷中引起細胞、組織損傷的最重要的炎性介質之

7、一,腸道內大量的細菌產生的內毒素可刺激TNF-a的合成和釋放。研究證實在IBD患者糞便中TNF-a的濃度與結腸炎癥的嚴重程度相關。 本研究目的是進一步開展hBD-2啟動子區(qū)域態(tài)性檢測,并通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)研究NOD2基因P268S改變及hBD-2啟動子區(qū)域多態(tài)性突變對先天性防御活性物質即hBD-2的影響。 材料和方法: 1、選取南方醫(yī)院消化科及普外科2004年01月到2007年10月經內鏡檢查和(或)手術

8、及病理確診的CD患者30例,門診健康體檢者30例,空腹抽取靜脈血5ml;提取靜脈血基因組DNA后,聚合酶鏈反應擴增目的片段。將PCR產物純化后采用直接測序,通過與基因數據庫對照并分析測序圖,并對基因型和等位基因進行統(tǒng)計學分析。 2、利用基因克隆技術構建包含hBD-2基因啟動子活性區(qū)域的雙熒光素酶報告基因質粒hBD-2-780-luc;利用定點突變技術在hBD-2啟動子序列-233位點引入堿基突變,構建克羅恩病相關突變體hBD-2

9、-mut-luc。 3、質粒hBD-2-780-luc和pcDNA-wild-NOD2-HA共轉染HEK293T細胞,使用不同濃度的LPS和TNF-a來刺激HEK293T細胞,通過檢測熒光素酶活性來選擇最佳濃度,取該濃度用于研究NOD2基因多態(tài)性改變及hBD-2啟動子區(qū)多態(tài)性改變對hBD-2轉錄活性的影響。 4、hBD-2報告基因質粒和NOD2真核表達載體共轉染HEK293T細胞,在LPS和TNF-a分別刺激細胞24h后

10、,通過Western-blot及RT-PCR法檢測NOD2蛋白表達水平和轉錄水平;用GloMaxTM20/20Luminometer測定雙熒光素酶的表達來研究hBD-2轉錄活性變化。 5、質粒hBD-2-780-luc和pcDNA-wild-NOD2-HA共轉染HEK293T細胞,24h后同時加入TNF-a和BAY11-7082再培養(yǎng)24h,然后測定熒光素酶表達活性來研究hBD-2轉錄活性變化。 6、本文均采用SPSS1

11、3.0進行統(tǒng)計分析。第一章中的基因型和等位基因頻率作為計數資料用頻數表示,采用x2檢驗。第三章中濃度梯度實驗組間熒光素酶活性倍數分析使用單向方差分析;LPS處理組間采用析因設計資料的方差分析;TNF-a處理組間采用單向方差分析;當P<0.05時,差異具有統(tǒng)計學意義。 結果: 1、CD組和健康對照組的基因型數量在統(tǒng)計學上有顯著性差異,CD組的雜合子數量多于健康對照組(P=0.016);CD組與健康對照組在基因頻率上有顯著性

12、差異,在CD中等位基因C的頻數高于健康組(P=0.039)。 2、經克隆、酶切鑒定及基因測序證實成功構建hBD-2啟動子熒光素酶報告基因載體hBD-2-780-luc及其克羅恩病相關突變體hBD-2-mut-luc。 3、各表達載體瞬時轉入HEK293T細胞48小時后,通過WesternBlot及RT-PCR在pcDNA-wild-NOD2-HA轉染組和pcDNA-NOD2-P268S-HA轉染組中檢測到NOD2蛋白和m

13、RNA的表達,而pcDNA3.0空載體轉染組未檢測到NOD2蛋白的表達。 4、用不同濃度LPS刺激細胞24h后,HEK293T細胞hBD-2轉錄活性有劑量依賴性,劑量越高,hBD-2轉錄活性越低,當LPS濃度為1μg/μl時較無LPS刺激時顯著降低(P=0.020)。 5、在TNF-a刺激細胞24h后,HEK293T細胞hBD-2轉錄活性相對升高,并有劑量依賴性,濃度為5ng/ml時表達活性增強至無TNF-a刺激時的2.

14、5倍以上(P=0.002),但當濃度達到10ng/ml時則對hBD-2轉錄活性無顯著影響(P=0.442)。 6、LPS存在時,pcDNA-wild-NOD2-HA轉染組和pcDNA-NOD2-P268S-HA轉染組hBD-2轉錄活性有顯著性差異(P=0.008);NOD2蛋白的P268S多態(tài)性改變和細菌壁成分LPS刺激對hBD-2的誘導作用無交互作用,相互獨立(P=0.152);hBD-2-780-luc轉染組和hBD-2-m

15、ut-luc轉染組的hBD-2轉錄活性無顯著性差異(P=0.053);hBD-2啟動子多態(tài)性改變和細菌壁成分LPS刺激對NOD2蛋白介導的防御素轉錄無交互作用,相互獨立(P=0.247)。 7、在TNF-a(5ng/ml)刺激時pcDNA-wild-NOD2-HA轉染組和pcDNA-NOD2-P268S-HA轉染組hBD-2轉錄活性無顯著性差異(P=0.064);而在TNF-a(5ng/ml)刺激時,hBD-2-mut-luc轉

16、染組和hBD-2-780-luc轉染組的hBD-2轉錄活性有顯著性差異(P=0.006)。 8、在TNF-a(5ng/ml)刺激轉染有pcDNA-wild-NOD2-HA的細胞之前用NF-KB抑制劑BAY11-7082預處理可明顯抑制hBD-2轉錄的活化(P=0.002)。 結論: 1、在部分中國人CD中經過直接測序法發(fā)現CD相關的單核苷酸多態(tài)位點:hBD-2啟動子區(qū).233位點,堿基G→C。 2、成功構

17、建了hBD.2啟動子熒光素酶報告載體hBD-12-780-luc及其克羅恩病相關突變體hBD-2-mut-luc,并在HEK293T細胞中活化,該載體可作為研究CD發(fā)病機制及藥物研發(fā)的工具。 3、過量的抗原刺激可能抑制先天性防御物質的產生;適量的炎癥因子(TNF-a)激發(fā)先天性防御物質的產生,過量的炎癥因子則抑制其產生。 4、NOD2蛋白的表達可以促進HEK293T細胞的先天性免疫反應,介導先天性免疫;NOD2蛋白的P2

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