利用CRISPRi干擾研究MyoG和Myf6基因?qū)ε９趋兰⌒l(wèi)星細胞分化的影響.pdf

1、骨骼肌的生長發(fā)育狀況關(guān)系到動物的產(chǎn)肉量與肉質(zhì)。作為成體中的肌源干細胞，骨骼肌衛(wèi)星細胞(MDSCs)被廣泛應(yīng)用于骨骼肌發(fā)育的體外研究。骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖分化生物學過程極其復雜，這其中涉及到多種轉(zhuǎn)錄因子及細胞信號分子的調(diào)控作用。肌肉生長主要依賴于骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖分化以及進一步的肌纖維長度增加和周徑的增粗。肌細胞生成素(MyoG)、生肌因子6(Myf6)為生肌調(diào)節(jié)因子(MRFs)家族的重要成員，兩者作為骨骼肌發(fā)育的重要調(diào)控因子在肌肉分化

2、過程中起著舉足輕重的作用。另一方面，近來基于CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)系統(tǒng)開發(fā)而來的CRISPR干擾(CRISPRi)技術(shù)，由于其能夠高效的干擾基因表達，而成為基因功能研究的重要工具。考慮到MyoG、My f6基因在骨骼肌衛(wèi)星細胞分化過程中的重要作用，本研究以牛骨骼肌衛(wèi)星細胞為實驗材料，利用CRISPRi干擾技術(shù)干擾MyoG、My f6

3、基因，探究在MyoG、My f6基因低表達的情況下，肌肉分化相關(guān)基因在分化過程中的表達變化，分析總結(jié)MyoG、My f6基因在肌肉分化過程中的作用及相互關(guān)系。本研究利用CRISPRi技術(shù)分別將構(gòu)建的MyoG、Myf6基因干擾載體轉(zhuǎn)染牛骨骼肌衛(wèi)星細胞，并誘導分化，通過Real Time PCR和Western Blot技術(shù)篩選獲得干擾效率最高的表達載體，以MyoG和My f6基因高效干擾載體分別進行僅干擾MyoG基因、僅干擾My f6基因

4、、同時干擾MyoG和My f6基因，干擾MyoG同時過表達My f6基因4個細胞處理組，通過免疫熒光觀察并統(tǒng)計肌管形成情況，并采用Real Time PCR和Western Blot分別在mRNA和蛋白水平上檢測肌肉分化重要功能基因MyoG、My f6、MYH2、MyoD的表達情況。
　　取得的研究結(jié)果如下:
　　(1)干擾MyoG基因后，My f6基因表達升高，My f6基因呈現(xiàn)代償現(xiàn)象，MYH2基因表達降低，MyoD基因

5、表達升高;且MyoG基因干擾效率越高，My f6基因表達升高的越多，表現(xiàn)出明顯的代償效應(yīng);
　　(2)干擾My f6基因后，MyoG基因表達降低，MYH2基因表達降低，MyoD基因表達升高;
　　(3)同時干擾MyoG和My f6基因后，MYH2基因表達降低，MyoD基因表達升高;
　　(4)干擾Myf6基因后，MyoG基因未表現(xiàn)出對My f6基因的代償效應(yīng)，MyoG基因表達量反而下降，說明Myf6基因與MyoG基因的

6、代償作用是單向的而非相互的;
　　(5)干擾MyoG基因后，盡管Myf6基因表現(xiàn)出代償性的升高，但肌肉分化的標志基因MYH2基因的表達量降低，說明Myf6基因的代償效應(yīng)還不足以完全彌補MyoG基因?qū)毎只斐傻挠绊?
　　(6)同時干擾MyoG和Myf6基因后就嚴重的阻礙了細胞的分化，MYH2基因的表達顯著下降，但與單獨干擾相比，未表現(xiàn)出疊加效應(yīng);
　　(7)無論敲低MyoG或Myf6基因，MyoD基因的表達量均有