核因子Akirin對(duì)免疫缺陷(IMD)信號(hào)途徑的調(diào)控研究.pdf

1、對(duì)蝦的養(yǎng)殖是我國(guó)重要的水產(chǎn)支柱產(chǎn)業(yè)。但是近年來(lái)的病害和環(huán)境污染使對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)遭受巨大的損失。因此，深入研究對(duì)蝦的先天免疫防御機(jī)制，對(duì)于控制對(duì)蝦疾病具有重要的意義。
　　對(duì)蝦主要依賴先天免疫來(lái)防御外來(lái)病原微生物的入侵。免疫缺陷(Immunedeficiency，IMD)和Toll信號(hào)通路在調(diào)控對(duì)蝦免疫系統(tǒng)抵御外來(lái)微生物的感染中起到關(guān)鍵的作用。對(duì)蝦中的核因子活化B細(xì)胞κ輕鏈增強(qiáng)子(Nuclear factorkappa-light-ch

2、ain-enhancer of activated B cells，NF-κB)通路中很多的關(guān)鍵元件已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，并對(duì)它們的主要功能進(jìn)行了研究。Akirin作為一種新的NF-κB信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄輔助因子，在果蠅和哺乳動(dòng)物中均有發(fā)現(xiàn)，其從無(wú)脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物中都具有高度保守性。在哺乳動(dòng)物中，Akirin家族有兩組同系物為Akirin1和Akirin2,在無(wú)脊椎動(dòng)物中只有一個(gè)Akirin基因，并與脊椎動(dòng)物中的Akirin2具有高度同源性。作為一種

3、核因子，Akirin在多種生物過(guò)程中具有重要的功能，例如免疫反應(yīng)，骨骼肌發(fā)生，胚胎發(fā)育和腫瘤轉(zhuǎn)移。在果蠅的免疫缺陷(IMD)信號(hào)通路(與哺乳動(dòng)物的腫瘤壞死因子受體(TNFR)信號(hào)通路相似）中，Akirin可以促進(jìn)NF-κB因子的轉(zhuǎn)錄。有些研究顯示，在Akirin2敲降的小鼠中，使用TLR、IL-1β和TNFα刺激后，NF-κB轉(zhuǎn)錄的目的基因受到明顯的抑制。進(jìn)一步地研究表明，染色質(zhì)重塑SWI/SNF復(fù)合物中的Brahma相關(guān)60千道爾頓蛋

4、白(Brahma-associated protein of60 kDa，Bap60)可以與Akirin相互作用，參加果蠅的免疫防御。哺乳動(dòng)物中，Akirin2作為橋梁與NF-κB、SWI/SNF復(fù)合物中的BRG1相關(guān)60千道爾頓因子(BRG1-Associated Factor60kDa，BAF60)和IκB-ζ組合成復(fù)合物，該復(fù)合物調(diào)節(jié)NF-κB p50的轉(zhuǎn)錄活性，在抵御病毒和細(xì)菌感染中發(fā)揮作用。Akirin序列中沒(méi)有明顯的DNA或

5、者RNA結(jié)合基序，其與NF-κB和其上游信號(hào)分子之間存在一種潛在的聯(lián)系。因此Akirin在NF-κB信號(hào)通路中的作用機(jī)理需要進(jìn)一步研究。
　　本文研究了日本囊對(duì)蝦Akirin及其相互作用基因在對(duì)蝦免疫防御中的功能。日本囊對(duì)蝦Akirin的cDNA全長(zhǎng)為1448 bp，其中645 bp編碼214個(gè)氨基酸的開(kāi)放閱讀框。序列分析顯示其包含2個(gè)核定位信號(hào)，分別為26～30位(KRRRC)和78～81位(KRRK)。日本囊對(duì)蝦Bap60的c

6、DNA全長(zhǎng)為1827 bp，1593 bp編碼530個(gè)氨基酸的開(kāi)放閱讀框。序列中包含1個(gè)SWI復(fù)合物結(jié)構(gòu)域。日本囊對(duì)蝦的14-3-3ζ的cDNA全長(zhǎng)為2098 bp，其中741 bp編碼246個(gè)氨基酸的開(kāi)放閱讀框。ExPASy預(yù)測(cè)14-3-3ζ的理論等電點(diǎn)為4.65,分子量為27.9 KDa。對(duì)不同生物中的Akirin，Bap60和14-3-3氨基酸進(jìn)行比對(duì)分析，顯示均具有較高的相似性。
　　Akirin主要表達(dá)于日本囊對(duì)蝦的血細(xì)

7、胞、心臟和腸中。在革蘭氏陰性菌鰻弧菌刺激之后，Akirin表現(xiàn)為表達(dá)上調(diào)，但在革蘭氏陽(yáng)性菌的金黃色葡萄球菌刺激之后，Akirin的表達(dá)幾乎沒(méi)有變化。這提示了在日本囊對(duì)蝦中，Akirin主要在應(yīng)對(duì)革蘭氏陰性菌感染的免疫防御中發(fā)揮作用。我們推測(cè)Akirin通過(guò)IMD信號(hào)通路來(lái)對(duì)抗革蘭氏陰性菌的感染。為了確定在對(duì)蝦中Akirin確實(shí)參與IMD途徑的調(diào)控，我們利用RNA干擾的方法敲低IMD轉(zhuǎn)錄因子Relish的表達(dá)，再感染弧菌，檢測(cè)了九種抗菌肽

8、的表達(dá)，包括五種抗脂多糖因子(antilipopolysaccharidefactors，alfs)、兩種甲殼肽(Crustins)、一種溶菌酶(Lysozyme)和一種對(duì)蝦素(penaeidin，pen)。發(fā)現(xiàn)在革蘭氏陰性菌刺激后，alf-b1,alf-c1,alf-c2,df-d2和Pen2五種抗菌肽的表達(dá)受到了抑制。說(shuō)明IMD途徑在革蘭氏陰性菌刺激條件下，調(diào)控這五種抗菌肽的轉(zhuǎn)錄。利用RNA干擾的方法敲低Akirin的表達(dá)后，再感染

9、弧菌，檢測(cè)抗菌肽的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)受IMD-Relish調(diào)控的抗菌肽alf-b1,alf-c2和alf-d2的表達(dá)也被抑制，推測(cè)Akirin可能與Relish協(xié)同作用，調(diào)控這些抗菌肽的表達(dá)。利用下拉(Pull-down)實(shí)驗(yàn)證明在體外Akirin可以與Relish的IPT結(jié)構(gòu)域相互作用。根據(jù)Akirin可能與Braham(SWI/SNF) ATP依賴的染色質(zhì)重塑復(fù)合物中的Bap60亞基結(jié)合，調(diào)控IMD信號(hào)通路的報(bào)道。我們克隆了對(duì)蝦SWI/SN

10、F染色質(zhì)重塑復(fù)合物的Bap60亞基。進(jìn)一步利用RNA干擾的方法敲降其表達(dá)并感染弧菌，結(jié)果顯示與Akirin敲降后的對(duì)蝦中抗菌肽表達(dá)抑制的情況是一致的。Pull-down實(shí)驗(yàn)顯示Akirin可以與Bap60相互作用。因此，Akirin可以與Braham(SWI/SNF)ATP-依賴的染色質(zhì)重塑復(fù)合物中的Bap60亞基以及Relish協(xié)同作用，通過(guò)調(diào)控多種抗菌肽的表達(dá)清除病原菌。另外，序列分析發(fā)現(xiàn)日本囊對(duì)蝦Akirin序列中含有一個(gè)與14-

11、3-3蛋白相互作用的位點(diǎn)(SPP)，Pull-down和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Akirin具有與14-3-3結(jié)合的功能。同時(shí)，14-3-3也可以與Relish的RHD結(jié)構(gòu)域相互作用。在干擾Akirin的對(duì)蝦用鰻弧菌感染后，與對(duì)照相比抗脂多糖因子等抗菌肽的表達(dá)顯著下調(diào)，而干擾14-3-3的對(duì)蝦用鰻弧菌刺激后，多種脂多糖因子的表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)。
　　綜合以上的結(jié)果，Akirin可以與Relish協(xié)同作用參加IMD-Relish信號(hào)通路，當(dāng)A