2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、背景:支氣管哮喘是一類由多種免疫細胞參與的慢性炎癥性氣道疾病,可發(fā)生于任何年齡。近年來,越來越多的研究發(fā)現(xiàn),支氣管哮喘患者體內(nèi)存在著一群非T非B的免疫細胞,即固有淋巴細胞(innate lymphoid cells,ILCs)。此類細胞不表達任何譜系的標(biāo)志,但是其具備類似T淋巴細胞的功能。根據(jù)與此類細胞相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子、表面表達的受體以及其活化后分泌的特征性細胞因子,可將ILCs分為三類,包括ILC1s、ILC2s和ILC3s。在健康個體

2、體內(nèi),ILCs的量微乎其微,而在病理狀態(tài)下可被活化而比例增加。支氣管哮喘發(fā)作時,活化的ILC2s分泌IL-13、IL-5等細胞因子,維持Th2極化狀態(tài),參與免疫損傷。在這些促炎細胞因子的作用下,使氣道局部呈現(xiàn)氣道高反應(yīng)性,形成典型的哮喘癥狀。
  RORα,是維甲酸相關(guān)的孤核受體家族的成員之一,其在各種生物體的多種組織均有表達。作為ILC2s的特征性轉(zhuǎn)錄因子,RORα在ILC2s分化增殖過程中以及功能的發(fā)揮方面發(fā)揮重要作用。目前的

3、研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)小鼠缺失RORα?xí)r,其體內(nèi)ILC2s的數(shù)量減少,并且對于寄生蟲的免疫能力減弱。而缺乏ILC2s的小鼠經(jīng)過繼轉(zhuǎn)移ILC2s,則小鼠的ILC2s功能可獲重建。
  目的:為了探討RORα于支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展中的作用,為臨床哮喘病的治療尋找新的途徑。本研究在建立哮喘小鼠模型的基礎(chǔ)上,分析ILC2s在模型鼠的分布,并經(jīng)構(gòu)建RORα表達載體研究其對ILC2s的調(diào)控作用,探討用于干預(yù)哮喘模型鼠的可能性。旨在為RORα的應(yīng)用研究奠定

4、理論依據(jù)和試驗基礎(chǔ)。
  材料與方法
  (1)臨床病例分析:流式細胞術(shù)檢測支氣管哮喘患者外周血單個核細胞中ILC2s的比例;RT-qPCR方法檢測外周血單個核細胞中RORα、T-bet、GATA3、IL-33、IL-25、IL-13、IL-5、IL-4的mRNA表達水平;ELISA法測定血清中的IL-33、IL-13、IL-5的蛋白含量;直線回歸法分析RORα的mRNA表達水平與ILC2s活性的相關(guān)性、RORα的mRNA表

5、達水平與Th1、Th2細胞相關(guān)分子的相關(guān)性、ILC2s的特征性細胞因子mRNA表達水平與Th2細胞特征性細胞因子的相關(guān)性。
  (2)小鼠哮喘模型的誘導(dǎo)和RORα表達載體的體內(nèi)干預(yù)試驗:
  1)構(gòu)建RORα表達載體:無菌分離小鼠脾臟組織,運用RT-PCR從小鼠脾臟組織的mRNA中克隆出mRORα全長編碼區(qū)的cDNA,并將該cDNA連接到PMD-18T載體,同時鑒定該載體序列。再定向克隆入腺病毒的穿梭載體pDC316-mCM

6、V-EGFP,并與骨架載體PBHGloxdetalE1,3Cre一同于HEK293內(nèi)包裝,并純化腺病毒。
  2)小鼠哮喘模型的誘導(dǎo)及RORα表達載體的干預(yù):建立OVA誘導(dǎo)的支氣管哮喘模型。利用Ad-RORα干預(yù)后。運用H&E染色的方法觀察肺組織病理學(xué)的變化;流式細胞儀分析模型鼠外周血ILC2s細胞比例;用細胞計數(shù)池計數(shù)BALF中炎癥細胞的浸潤情況;ELISA檢測血清IL-33、IL-13、IL-5等細胞因子的含量;肺組織和支氣管

7、肺泡灌洗液中RORα、IL-33、IL-13、IL-5、IL-4和GATA3等mRNA表達水平用RT-qPCR法測定、肺組織中RORα、ST2蛋白的表達以Western-blot法檢測。
  結(jié)果:
  (1)支氣管哮喘患者外周血中ILC2s的比例相對于正常對照者明顯升高,且血清IL-33以及ILC2s的特征性細胞因子IL-13、IL-5的蛋白含量也隨之升高;同時,外周血單個核細胞中RORα、IL-33、IL-13、IL-5

8、、IL-4、GATA3的mRNA表達水平也呈升高趨勢,而Th1細胞的轉(zhuǎn)錄因子T-bet的mRNA則呈降低趨勢。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,RORα與ILC2s呈正相關(guān),IL-33亦與ILC2s的特征性細胞因子IL-13、IL-5、IL-4呈正相關(guān)。
  (2)成功克隆了小鼠RORα基因的全長序列,經(jīng)測序無誤。經(jīng)定向克隆的方法,成功將RORα的全長基因克隆入pDC316-mCMV-EGFP,經(jīng)過PCR、酶切分析和測序鑒定均無誤。
  

9、(3)腺病毒的包裝:成功大量制備了攜帶小鼠RORα的穿梭載體pDC316-RORα-mCMV-EGFP、骨架載體PBHGloxdetalE1,3Cre,隨后將穿梭載體pDC316-RORα-mCMV-EGFP與骨架載體PBHGloxdetalE1,3Cre一同轉(zhuǎn)染狀態(tài)良好的HEK293細胞,經(jīng)過純化后,成功地包裝出了高滴度的攜帶小鼠RORα的腺病毒。
  (4)小鼠哮喘模型的建立:用OVA成功誘導(dǎo)小鼠哮喘動物模型,經(jīng)模型鼠肺組織H

10、&E染色鏡檢,可見大量炎癥細胞浸潤。與OVA組和OVA+Ad-EGFP組相比,Ad-RORα處理的模型鼠,其肺組織中的炎癥細胞增多更為明顯,且哮喘癥狀更為明顯,出現(xiàn)強烈地抓耳撓腮、抬起前肢、大小便失禁、呼吸急促等哮喘表現(xiàn)。同時,處理組小鼠與未處理的OVA誘模組和Ad-EGFP處理組相比,其支氣管肺泡灌洗液中IgE的水平明顯增加。
  (5)哮喘模型中ILC2s相關(guān)的因子檢測:Ad-RORα處理組循環(huán)ILC2s明顯高于未處理的模型鼠

11、和Ad-EGFP對照組,提示ILC2s參與的哮喘的發(fā)病過程,而轉(zhuǎn)錄因子RORα發(fā)揮了推波助瀾的作用。此外,在Ad-RORα處理組,促進ILC2s活化的IL-33,ILC2s的特征性細胞因子IL-13、IL-5和轉(zhuǎn)錄因子GATA3,以及Th2細胞因子IL-4等均明顯升高。同時,我們亦發(fā)現(xiàn)IL-33蛋白升高,升高的IL-33進一步促進ILC2s的增殖活化。
  結(jié)論:哮喘患者機體ILC2s數(shù)量及其相關(guān)分子表達增加,與此同時,上調(diào)的RO

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