mTOR信號(hào)途徑調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)控能力的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是存在于骨髓和其他多種組織中的成體干細(xì)胞。MSCs具有廣泛的免疫調(diào)控作用，目前已在臨床上應(yīng)用于移植物抗宿主?。╣raft-versus-host disease，GVHD）和自身免疫性疾病等的治療。慢性GVHD(chronic GVHD，cGVHD)是影響異基因造血干細(xì)胞移植(hematopoieticstem cell transplantation，HS

2、CT)效果的主要并發(fā)癥，其臨床表現(xiàn)與多種自身免疫性疾病類(lèi)似。有研究報(bào)道MSCs在部分自身免疫性疾病中存在衰老、凋亡和增殖能力減弱等現(xiàn)象，可能參與了疾病的發(fā)病過(guò)程。cGVHD患者M(jìn)SCs是否也有類(lèi)似現(xiàn)象，能否用自體MSCs進(jìn)行細(xì)胞治療尚不明確。
　　MSCs發(fā)揮免疫調(diào)控作用需要炎性微環(huán)境的激活。然而，在炎性細(xì)胞因子作用下，MSCs出現(xiàn)損傷并增加免疫原性，限制了其在GVHD等多種疾病中的治療作用。mTOR信號(hào)途徑參與調(diào)控多種免疫反應(yīng)，

3、對(duì)T細(xì)胞、B細(xì)胞激活和分化等具有重要的調(diào)控作用。另外，mTOR信號(hào)途徑還參與調(diào)控B16黑色素瘤細(xì)胞等表面MHC分子的表達(dá)。然而，在MSCs中mTOR信號(hào)途徑是否能調(diào)節(jié)免疫抑制能力和免疫原性尚不清楚。
　　本研究旨在闡明MSCs在cGVHD發(fā)生發(fā)展中的作用，并探討自體MSCs治療cGVHD的可行性;探討mTOR信號(hào)途徑對(duì)MSCs免疫抑制能力和免疫原性的調(diào)節(jié)作用及具體機(jī)制，為改善MSCs治療GVHD等疾病奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第一

4、章、慢性移植物抗宿主病患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性研究
　　目的:比較分析HSCT后cGVHD患者和無(wú)cGVHD患者骨髓MSCs的表型和功能，闡明MSCs在cGVHD發(fā)生發(fā)展中的作用;進(jìn)一步與正常供者骨髓MSCs比較，探討cGVHD患者M(jìn)SCs用于自體移植的可行性。
　　方法:分離培養(yǎng)25例異基因HSCT后cGVHD患者，16例無(wú)cGVHD患者和19例正常供者的骨髓MSCs，取第3-5代細(xì)胞進(jìn)行比較分析。短串聯(lián)重復(fù)序列(S

5、TR)-PCR檢測(cè)HSCT后骨髓MSCs來(lái)源;成纖維細(xì)胞集落形成單位(CFU-F)培養(yǎng)法檢測(cè)MSCs在骨髓中的數(shù)量;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記、凋亡和免疫抑制能力;茜素紅染色和油紅O染色分別檢測(cè)MSCs成骨和成脂分化能力;衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色檢測(cè)細(xì)胞衰老;ELISA檢測(cè)MSCs正常培養(yǎng)和與外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)共培養(yǎng)后免疫抑制因子分泌水平;熒光定量PCR檢測(cè)多能性相關(guān)基因、衰老相關(guān)基因和分化相關(guān)基因表達(dá)

6、水平;Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MSCs遷移能力。
　　結(jié)果:HSCT后cGVHD患者和無(wú)cGVHD患者骨髓MSCs都來(lái)自患者自身。MSCs表面都強(qiáng)表達(dá)CD73、CD90、CD105，中等表達(dá)HLA-ABC，不表達(dá)CD34、CD45、CD11b、CD19和HLA-DR。兩組MSCs在骨髓中的數(shù)量相當(dāng)，具有相似的細(xì)胞形態(tài)、增殖和自我更新能力、分化潛能和遷移能力。MSCs的細(xì)胞衰老和凋亡百分比也無(wú)明顯差異。兩組MSCs的免疫抑制能力無(wú)

7、明顯區(qū)別，都能顯著抑制植物凝集素(PHA)活化的PBMCs增殖;與CD4+T細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)相比，MSCs與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)后，能明顯增加CD4+CD25hiCD127-Tregs的比例;MSCs正常培養(yǎng)或與PBMCs共培養(yǎng)后免疫抑制因子TGF-β1、IL-10、HGF、PGE2的分泌水平也類(lèi)似。另外，與正常供者骨髓MSCs相比，盡管cGVHD組MSCs在骨髓中的數(shù)量減少，而在表型和其他功能方面均無(wú)顯著差別。
　　結(jié)論:MSCs不

8、參與cGVHD的發(fā)生發(fā)展，cGVHD患者M(jìn)SCs具有正常的表型和功能，可能適用于自體細(xì)胞治療。
　　第二章、mTOR信號(hào)途徑調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞免疫抑制能力的作用及機(jī)制
　　目的:闡明mTOR信號(hào)途徑對(duì)骨髓MSCs免疫抑制能力的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。
　　方法:MSCs預(yù)處理不同濃度雷帕霉素后與活化的PBMCs、小鼠脾細(xì)胞以及CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)5天，流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)PBMCs、小鼠脾細(xì)胞增殖率和CD4+CD25hiCD

9、127-細(xì)胞比例。熒光定量PCR檢測(cè)IFN-γ、TNF-α受體和免疫抑制因子mRNA表達(dá)水平;Western blotting檢測(cè)COX-2、mPGES-1等蛋白表達(dá)水平;慢病毒介導(dǎo)的shRNA干擾驗(yàn)證COX-2在MSCs免疫抑制中的作用;ELISA檢測(cè)雷帕霉素預(yù)處理后MSCs培養(yǎng)上清PGE2的分泌水平。
　　結(jié)果:雷帕霉素預(yù)處理抑制mTOR信號(hào)途徑后顯著增強(qiáng)MSCs對(duì)PBMCs增殖的抑制作用，對(duì)誘導(dǎo)Tregs作用沒(méi)有明顯影響。雷

10、帕霉素預(yù)處理后，MSCs也能明顯抑制抗CD3/CD28抗體活化的小鼠脾細(xì)胞增殖。抑制mTOR信號(hào)途徑不影響炎性細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α受體的表達(dá)，但能顯著提高COX-2的mRNA和蛋白水平以及PGE2分泌水平。IFN-γ、TNF-α也增強(qiáng)COX-2和PGE2的表達(dá)，雷帕霉素預(yù)處理后能在炎性細(xì)胞因子作用基礎(chǔ)上進(jìn)一步上調(diào)。加入COX-2特異性抑制劑NS-398或shRNA干擾后能減弱雷帕霉素對(duì)MSCs免疫抑制的促進(jìn)作用。雷帕霉素引起M

11、SCs中NF-κB入核，加入NF-κB抑制劑PDTC后雷帕霉素對(duì)COX-2蛋白表達(dá)的上調(diào)作用減弱。
　　結(jié)論:雷帕霉素預(yù)處理抑制mTOR信號(hào)途徑后通過(guò)上調(diào)MSCs的COX-2和PGE2表達(dá)增強(qiáng)免疫抑制作用。
　　第三章、mTOR信號(hào)途徑調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞免疫原性的作用
　　目的:闡明mTOR信號(hào)途徑對(duì)骨髓MSCs表面HLA-ABC和HLA-DR表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。
　　方法:雷帕霉素預(yù)處理MSCs，正常培養(yǎng)或IFN

12、-γ作用不同時(shí)間后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面HLA-ABC+、HLA-DR+細(xì)胞比例和平均熒光強(qiáng)度;熒光定量PCR檢測(cè)IRF1、CIITA以及蛋白酶體亞單位和MHC-Ⅰ類(lèi)分子組裝相關(guān)分子伴侶的mRNA表達(dá)水平;Western blotting檢測(cè)Stat1蛋白磷酸化水平。
　　結(jié)果:雷帕霉素處理對(duì)MSCs表面的HLA-ABC表達(dá)沒(méi)有影響。IFN-γ處理3天后明顯增強(qiáng)HLA-ABC平均熒光強(qiáng)度，并上調(diào)蛋白酶體亞單位LMP2、LMP7、L

13、MP10以及分子伴侶Tapasin等的mRNA表達(dá)水平。雷帕霉素對(duì)IFN-γ作用下的HLA-ABC表達(dá)也沒(méi)有影響，但能提高Tapasin、LMP7和LMP10的表達(dá)水平。MSCs正常條件下不表達(dá)HLA-DR，但在IFN-γ作用下表達(dá)明顯上升。IFN-γ作用后Stat1蛋白的磷酸化水平和IRF1、CIITA的mRNA表達(dá)水平也明顯上升。雷帕霉素對(duì)Stat1磷酸化水平和IRF1、CIITA的表達(dá)水平?jīng)]有影響，然而高濃度雷帕霉素預(yù)處理能顯著減