花生AhbHLK1參與調(diào)控FAD2基因在種子中表達(dá)的研究.pdf

1、bHLH轉(zhuǎn)錄因子是植物轉(zhuǎn)錄因子中的一個(gè)大家族，植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子不僅在植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育中扮演著重要角色，同時(shí)也參與到植物對(duì)干旱、鹽及冷脅迫等各種脅迫的應(yīng)答及激素信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程。
　　實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)同源克隆方法從花生中克隆到了1個(gè)與芝麻SebHLH同源的bHLH類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為AhbHLH1。酵母單雜交分析表明，其編碼的蛋白可能與花生FAD2基因啟動(dòng)子存在相互作用。對(duì)花生FAD2基因調(diào)控區(qū)序列分析發(fā)現(xiàn)，其起始密碼ATG上游

2、200bp的調(diào)控區(qū)存在4個(gè)E-BOX元件，-90bp～-78bp存在連續(xù)2個(gè)，-155bp處1個(gè)，-42bp處1個(gè)。本研究中，利用帶有His標(biāo)簽的原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了AhbHLH1蛋白，并通過(guò)His-Trap親和層析柱對(duì)蛋白進(jìn)行了分離純化。合成了3個(gè)生物素標(biāo)記的包括不同位置E-BOX的雙鏈DNA探針，并通過(guò)電泳遷移率檢測(cè)(Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA)分析了轉(zhuǎn)錄因子AhbHLH1與上

3、述3個(gè)探針的結(jié)合能力;同時(shí)構(gòu)建了用于瞬時(shí)表達(dá)研究AhbHLH1與FAD2基因體內(nèi)相互作用的效應(yīng)載體與報(bào)告載體。為進(jìn)一步研究花生AhbHLH1的功能，構(gòu)建了AhbHLH1的RNAi載體，并與AhbHLH1過(guò)表達(dá)載體（實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建）一起分別對(duì)花生進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化。
　　通過(guò)上述研究，取得了以下三方面主要結(jié)果:
　　1.EMSA分析AhbHLH1與AhFAD2基因調(diào)控區(qū)的結(jié)合。將AhbHLH1的5'端加上6個(gè)連續(xù)的His構(gòu)建到原核

4、表達(dá)載體pLM1中，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)帶有His標(biāo)簽的AhbHLH1融合蛋白，并通過(guò)His-Trap親和層析柱分離純化了目標(biāo)蛋白。將-90bp～-78bp連續(xù)2個(gè)E-BOX及其側(cè)翼序列28bp設(shè)計(jì)為探針P1;-155bp處的E-BOX及其側(cè)翼序列19bp設(shè)計(jì)為探針P2;-42bp的E-BOX及其側(cè)翼序列19bp設(shè)計(jì)為探針P3，分別探究AhbHLH1與這三組探針的結(jié)合情況。AhbHLH1與探針P1特異結(jié)合，與探針P2、P3不結(jié)合。初步證

5、明，AhbHLH1通過(guò)與AhFAD2基因啟動(dòng)子區(qū)域中-90bp～-78bp連續(xù)兩個(gè)E-BOX特異性結(jié)合調(diào)控其在種子中的表達(dá)。
　　2.構(gòu)建了用于原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)分析AhbHLH1與AhFAD2調(diào)控區(qū)體內(nèi)相互作用的效應(yīng)載體與報(bào)告載體。出發(fā)載體pBI121帶有CaMV35S全長(zhǎng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS表達(dá)框架，克隆100bp最小35S啟動(dòng)子，替代CaMV35S全長(zhǎng)啟動(dòng)子，構(gòu)建基本報(bào)告載體R0。克隆了與E-BOX元件對(duì)應(yīng)的三段調(diào)控區(qū)序列I1(

6、-167bp～24bp)、I2(-148bp～35bp)、I3(-167bp～55bp)，并利用In-Fusion方法分別插入到R0載體最小35S啟動(dòng)子之前，構(gòu)建了報(bào)告載體R1、R2、R3。為后續(xù)通過(guò)原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)分析AhbHLH1與目的啟動(dòng)子相互作用做準(zhǔn)備。
　　3.AhbHLH1基因過(guò)表達(dá)與RNAi載體的構(gòu)建及花生的遺傳轉(zhuǎn)化。利用SiRNA在線分析工具，對(duì)AhbHLH1基因的ORF區(qū)進(jìn)行SiRNA位點(diǎn)的分析，確定目的干擾片段

7、。構(gòu)建了AhbHLH1基因的RNAi載體與過(guò)表達(dá)載體（實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建）一同進(jìn)行了花生的遺傳轉(zhuǎn)化。經(jīng)卡那霉素篩選與PCR驗(yàn)證，獲得T0代過(guò)表達(dá)陽(yáng)性植株3株，T0代RNAi植株3株。
　　下一步，將通過(guò)瞬時(shí)表達(dá)分析，明確AhbHLH1與目的調(diào)控區(qū)相互作用;通過(guò)分析過(guò)表達(dá)和RNAi抑制AhbHLH1基因轉(zhuǎn)基因花生中AhFAD2基因的表達(dá)狀況，以及轉(zhuǎn)基因花生種子儲(chǔ)藏脂的脂肪組成，進(jìn)一步明確AhbHLH1調(diào)控AhFAD2基因在儲(chǔ)藏脂中不飽和