利用核糖體工程技術提高熒光假單胞菌PF-5菌株活性次級代謝產物產量.pdf

1、熒光假單胞菌Pf-5(Pseudomonas protegensPf-5)是一種重要的植物根際共生菌，它能夠產生多種具有抗菌作用的活性次級代謝產物，包括藤黃綠膿菌素(Plt)、2，4-二乙酰基藤黃酚(Phl)、硝吡咯菌素(Prn)、嗜鐵素等。這些次級代謝產物能拮抗不同的病原菌，在農作物土傳病害的生物防治研究中具有重要意義。野生型菌株中各類活性代謝產物的產量通常較低，在生物防治應用中效果有限。當前，通過核糖體工程技術(Ribosome e

2、ngineering)等手段進行菌株改良提高次級代謝產物產量是一條十分有效的途徑。
　　為了提高Pf-5菌株中活性的次級代謝產物的產量，本研究利用核糖體工程技術在高濃度的利福平篩選下，分離得到利福平自發(fā)抗性突變株60株。通過比較原始株Pf-5和突變株的抑菌效果發(fā)現(xiàn)，其中7株突變菌株較原始菌的抗真菌能力增強。對這7株突變菌株的DNA序列進行測序分析，發(fā)現(xiàn)均在編碼RNA聚合酶β亞基的rpoB基因出現(xiàn)點突變，保守區(qū)域rif-cluste

3、rⅠ區(qū)間第1591位的胞嘧啶突變?yōu)橄汆堰剩鄳木幋a氨基酸殘基由組氨酸突變?yōu)樘於０?。利用HPLC對次級代謝產物產量進行比較分析，結果表明相比于原始菌株，突變菌R55的2個主要抑菌活性代謝物（B和D）合成能力都有不同程度的提高:其中產物B提高了2.5倍左右，產物D提高了1.4倍左右。利用質譜等手段測定表明:產物B和D分別為:藤黃綠膿菌素、2，4-二乙酰藤黃酚。抑菌實驗表明產物藤黃綠膿菌素、2，4-二乙酰藤黃酚對煙草黑脛病菌和枇杷炭疽病菌

4、都顯示了不同程度的抑制效果。此外，本研究還在Pf-5菌株中過表達了R55的ropBR基因，構建了工程菌株Pf-rpoBR。工程菌能在高濃度的利福平抗性板上生長，CAS平板實驗發(fā)現(xiàn)工程菌的嗜鐵素產量有較大幅度的提升。
　　本研究以熒光假單胞菌Pf-5為出發(fā)菌株，引入利福平抗性突變位點，獲得一株兩種抗生素產量同時提高且抑菌活性大幅增強的突變株R55，并鑒定了其突變位點，經過反復傳代驗證，突變株的利福平抗性能穩(wěn)定遺傳。研究結果體現(xiàn)了核糖