利用重組工程技術(shù)標(biāo)記鼠疫菌染色體基因.pdf

1、背景：鼠疫是由鼠疫耶爾森氏菌(簡(jiǎn)稱(chēng)鼠疫菌)引起的自然疫源性烈性傳染病，可導(dǎo)致腺鼠疫和肺鼠疫。在人類(lèi)歷史上因鼠疫而死亡的人數(shù)達(dá)數(shù)以?xún)|計(jì)。目前，鼠疫雖得到有效地控制，但鼠疫菌作為最為烈性的生物戰(zhàn)劑和生物恐怖劑為恐怖組織所利用的可能性仍然存在。隨著對(duì)多種微生物基因組測(cè)序工作的完成，經(jīng)典的遺傳學(xué)研究方式也在發(fā)生變化。基于重組工程技術(shù)的一步法突變和標(biāo)記染色體基因已成為研究基因功能的重要手段。為加快研究鼠疫菌染色體基因及其產(chǎn)物的功能，將重組工程技術(shù)

2、應(yīng)用于標(biāo)記鼠疫菌染色體基因。 方法：將標(biāo)簽序列合成于引物中，通過(guò)融合PCR的方法將標(biāo)簽序列與卡那霉素或氯霉素抗性篩選基因連接構(gòu)建融合模塊，再將標(biāo)簽和抗性基因的融合模塊克隆到pBluescript載體，獲得模板載體。根據(jù)染色體目的基因的末端序列及其下游序列設(shè)計(jì)帶短同源臂引物(40-50bp)，從模板載體上PCR擴(kuò)增染色體目的基因的重組標(biāo)簽盒。將標(biāo)簽盒電轉(zhuǎn)化進(jìn)入表達(dá)Red重組系統(tǒng)的鼠疫菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)同源重組表位標(biāo)簽融合到目的基因的

3、下游，由此產(chǎn)生的C末端標(biāo)記的融合蛋白可經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)的免疫學(xué)方法檢測(cè)。在本研究中，我們采用的表位標(biāo)簽是Myc和6×His組和標(biāo)簽，稱(chēng)為MH標(biāo)簽，所采用的抗性篩選標(biāo)記是卡那霉素基因，標(biāo)記的是鼠疫菌染色體fpoS基因(sigam因子)。重組標(biāo)記克隆進(jìn)行DNA序列分析，C末端標(biāo)記的融合蛋白的表達(dá)通過(guò)針對(duì)Itis標(biāo)簽的單克隆抗體進(jìn)行Westernblot驗(yàn)證。 結(jié)果：Myc-His組合標(biāo)簽和卡那霉素抗性篩選基因的PCR融合產(chǎn)物成功的克隆到pBl