人臍帶血清器官培養(yǎng)液保存角膜的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、人臍帶血清器官培養(yǎng)液保存角膜的實(shí)驗(yàn)研究博士研究生趙靖指導(dǎo)教師謝立信教授摘要目的1配制胎牛血清器官培養(yǎng)液和人臍帶血清器官培養(yǎng)液，應(yīng)用兩種培養(yǎng)液對(duì)豬角膜進(jìn)行器官培養(yǎng)保存，觀察器官培養(yǎng)過(guò)程中豬角膜內(nèi)皮細(xì)胞、組織學(xué)、超微結(jié)構(gòu)、酶活性以及代謝等的變化。2應(yīng)用兩種培養(yǎng)液行器官培養(yǎng)保存4w的兔角膜進(jìn)行穿透性角膜移植，對(duì)比觀察兩種保存液對(duì)角膜移植術(shù)后角膜透明度、角膜內(nèi)皮、角膜厚度以及組織學(xué)的影響。3應(yīng)用兩種培養(yǎng)液對(duì)人角膜進(jìn)行器官培養(yǎng)保存，觀察器官培養(yǎng)過(guò)

2、程中角膜內(nèi)皮細(xì)胞、組織學(xué)、超微結(jié)構(gòu)和代謝變化，并觀察器官培養(yǎng)后角膜增殖能力和抗原性的變化。f／方法／L1配制器官培養(yǎng)液，培養(yǎng)液I含10％胎牛血清，培養(yǎng)液II含10％人臍帶血清。器官培養(yǎng)方法：3l℃密閉培養(yǎng)，保存期間不換液，器官培養(yǎng)后角膜放入含有5％葡聚糖的脫水液中脫水24h。豬眼113只，其中50對(duì)角膜分為兩組進(jìn)行配對(duì)器官培養(yǎng)保存，第一組：應(yīng)用培養(yǎng)液I；第二組：第一組的對(duì)側(cè)角膜，應(yīng)用培養(yǎng)液II。其余13個(gè)角膜作為正常對(duì)照。器官培養(yǎng)每周每

3、組各取出12個(gè)角膜在低張溶液中浸泡后在倒置顯微鏡下觀察角膜內(nèi)皮細(xì)胞，然后行內(nèi)皮細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)、茜素紅染色，顯微鏡下測(cè)量?jī)?nèi)皮細(xì)胞密度，將圖像轉(zhuǎn)入計(jì)算機(jī)分析細(xì)胞面積的變異系數(shù)(Coefficientofvariation，CV)、保存4w內(nèi)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)意義的差別。保存4w、脫水1d時(shí)與正常豬角膜相比，平均內(nèi)皮細(xì)胞丟失率第一組為1O98％，第二組為1085％。兩組角膜器官培養(yǎng)后的組織學(xué)、超微結(jié)構(gòu)、酶活性無(wú)明顯區(qū)別。隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，角膜上皮層

4、數(shù)減少，基質(zhì)水腫明顯，保存4w時(shí)角膜厚度約為正常角膜的34倍，脫水后仍水腫，內(nèi)皮層保持完整。掃描電鏡顯示內(nèi)皮細(xì)胞層完整，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變。酶組織化學(xué)染色顯示保存4w內(nèi)，上皮、內(nèi)皮細(xì)胞酶活性旺盛，基質(zhì)細(xì)胞的酶活性隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。葡萄糖代謝量第二組較第一組大，兩組葡萄糖利用糖酵解約占95％。器官培養(yǎng)前眼球棉拭子微生物檢測(cè)陽(yáng)性率為18％，器官培養(yǎng)液污染率為6％。2兔角膜器官培養(yǎng)4w角膜水腫約為正常角膜厚度的2～3倍，脫水1d透明。A、

5、B、C三組供體器官培養(yǎng)前角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度和角膜厚度無(wú)明顯差異。A、B組角膜移植術(shù)后2～3d角膜移植片開(kāi)始透明。A、B組之間術(shù)后角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度和角膜厚度無(wú)明顯差別，角膜內(nèi)皮細(xì)胞完整，術(shù)后7d、14d角膜中央厚度較保存前變薄。C組術(shù)后角膜持續(xù)水腫，無(wú)正常內(nèi)皮細(xì)胞。組織學(xué)顯示角膜上皮在器官培養(yǎng)4w后僅剩1～2層細(xì)胞，移植后迅速恢復(fù)，術(shù)后14d上皮厚度接近正常，但細(xì)胞形態(tài)尚未完全正常。器官培養(yǎng)兔角膜20例，沒(méi)有污染發(fā)生。3人角膜器官培養(yǎng)4w角

6、膜水腫約為正常角膜厚度的2倍，脫水12h后即透明。兩組角膜保存3w、4w后內(nèi)皮形態(tài)發(fā)生改變，多形性增加，沒(méi)有臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞密度2700～2900個(gè)／mm2，六邊形細(xì)胞比例大于40％。組織學(xué)顯示保存4w時(shí)角膜上皮多數(shù)僅剩1層細(xì)胞，內(nèi)皮層完整。掃描電鏡內(nèi)皮細(xì)胞層完整，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變。透射電鏡顯示內(nèi)皮細(xì)胞膜完整，細(xì)胞漿內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、糖原、高爾基復(fù)合體正常，細(xì)胞核正常，常染色質(zhì)多，異染色質(zhì)少，細(xì)胞漿內(nèi)可見(jiàn)大量空泡。內(nèi)皮細(xì)胞間連接