人卵泡液、胚胎培養(yǎng)液和冷凍精液中蛋白氧化應(yīng)激的研究.pdf

1、本研究擬在ROS在生殖方面的研究和蛋白氧化在人類其它組織研究的基礎(chǔ)上，以晚期氧化蛋白產(chǎn)物(advanced oxidation protein products，AOPP)為蛋白氧化損傷的指標(biāo)，觀察人卵泡液、胚胎培養(yǎng)液和低溫冷凍精液中是否存在ROS介導(dǎo)的蛋白氧化損傷，并初步探討其與卵母細胞和早期胚胎發(fā)育的關(guān)系。 第一章人卵泡液中蛋白氧化水平與IVF-ET結(jié)局參數(shù)的關(guān)系 【目的】 探討體外受精一胚胎移植(in vi

2、tro fertilization-embryo transplantation，IVF-ET)周期卵泡液中蛋白氧化水平與IVF-ET結(jié)局參數(shù)的關(guān)系。 【方法】 1．標(biāo)本來源和分組：卵泡液標(biāo)本來自南方醫(yī)院生殖中心2005年7月至2006年4月之間接受IVF-ET治療的64例不孕癥女性患者。病例選擇標(biāo)準(zhǔn)：年齡在25～38歲，平均年齡32.41±3.17歲；單純輸卵管性因素不孕；行常規(guī)IVF-ET治療；HCG日子宮內(nèi)膜在8.

3、0 mm以上，并且無內(nèi)膜病變。根據(jù)獲卵數(shù)分為三組，獲卵數(shù)<8個組16例，獲卵數(shù)8～15個組32例，獲卵數(shù)>15個組16例。根據(jù)患者年齡分為三組，年齡<30歲組11例，30歲～35歲組41例，>35歲組12例。 2．實驗方法：以AOPP作為蛋白氧化指標(biāo)，采用Vitko-Sarsat等介紹的方法進行測定。 3．統(tǒng)計學(xué)方法：所有數(shù)據(jù)應(yīng)用spss10.0統(tǒng)計軟件進行分析，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s±

4、s)或百分率(％)表示，采用偏相關(guān)分析、One-way ANOVA方差分析和獨立樣本t檢驗。 【結(jié)果】 1．卵泡液中AOPP水平與成熟卵母細胞比例(r=-0.401，p=0.001)、受精率(r=-0.257,P=0.045)、卵裂率(r=-0.290,P=0.024)、良好胚胎形成率(r=-0.520,P=0.000)均呈顯著負相關(guān)。 2．不同獲卵數(shù)組之間AOPP水平有顯著性差異(F=3.851，P=0.027

5、)，其中以獲卵數(shù)8～15個組AOPP水平最低，獲卵數(shù)<8個組最高。 3．非妊娠組AOPP水平高于妊娠組，有顯著性差異(t=3.665,P=0.001)。 4．不同年齡組AOPP水平差異有顯著性意義(F=15.919,P=0.000)，其中年齡>35歲組AOPP水平最高，<30歲組最低。 【結(jié)論】 1．IVF-ET周期中，卵泡液中存在蛋白氧化應(yīng)激現(xiàn)象。 2．卵泡液中高水平的AOPP可能對卵母細胞和早

6、期胚胎發(fā)育造成不良影響，繼而影響IVF結(jié)局。 第二章第一天胚胎培養(yǎng)液中蛋白氧化水平與早期胚胎發(fā)育的關(guān)系 【目的】探討：IVF-ET周期第一天胚胎培養(yǎng)液中蛋白氧化水平與早期胚胎發(fā)育的關(guān)系。 【方法】 1．標(biāo)本來源和分組：第一天胚胎培養(yǎng)液標(biāo)本來自南方醫(yī)院生殖中心2005年7月至11月之間進行常規(guī)IVF治療的30例患者和單精子卵細胞內(nèi)注射(intracytoplasmic sperm injeetion-emb

7、ryo transplantation，ICSI-ET)治療的30例患者。分組：根據(jù)受精類型分為兩組，常規(guī)IVF組30例和ICSI組30例。根據(jù)不孕婦女年齡分組，常規(guī)IVF組30例中年齡<30歲組4例，30歲～35歲組17例，>35歲組9例；ICSI組30例中年齡<30歲組8例，30歲～35歲組18例，>35歲組4例。 2．實驗方法：以AOPP作為蛋白氧化指標(biāo)，采用Vitko-Sarsat等介紹的方法進行測定。 3．統(tǒng)計

8、學(xué)方法：所有數(shù)據(jù)應(yīng)用spss10.0統(tǒng)計軟件進行分析，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用偏相關(guān)分析，獨立樣本t檢驗和One-wayANOVA方差分析。 【結(jié)果】 1．常規(guī)IVF周期中，第一天胚胎培養(yǎng)液中AOPP濃度在3.2μmol/l以下時，其變化與受精率(r=0.137,P=0.863)、卵裂率(r=0.623,P=0.377)、碎片10％以下胚胎形成率(r=-0.156，P=0.

9、844)、六細胞以上胚胎形成率(r=-0.444,P=0.556)無相關(guān)性；在3.2μmol/l以上時，AOPP水平與受精率(r=-0.226,P=0.338)、卵裂率(r=0.202,P=0.392)、碎片10％以下胚胎形成率(r=-0.232,P=0.325)、六細胞以上胚胎形成率(r=0.008,P=0.975)亦無相關(guān)性。 2．ICSI周期中，第一天胚胎培養(yǎng)液中AOPP濃度在3/2 μmol/l以下時，其變化與受精率(r

10、=-0.323,P=0.791)、卵裂率(r=0.014,P=0.991)、碎片10％以下胚胎形成率(r=0.238,P=0.847)、六細胞以上胚胎形成率(r=-0.029,P=0.982)無相關(guān)性；在3.2 μmol/l以上時，AOPP水平與受精率(r=-0.472,P=0.031)、碎片10％以下胚胎形成率(r=-0.482,P=0.027)、六細胞以上胚胎形成率(r=-0.548,P=0.010)呈顯著負相關(guān)，與卵裂率(r=-0

11、.096,P=0.679)無相關(guān)性。 3．常規(guī)IVF周期中，非妊娠組中AOPP水平高于妊娠組，有顯著性差異(t=3.160，P=0.004)；不同年齡組AOPP水平有顯著性差異(F=19.395,P=0.000)，其中不孕婦女年齡>35歲組AOPP水平最高，<30歲組最低。 4．ICSI周期中，非妊娠組AOPP水平高于妊娠組，有顯著性差異(t=2.421，P=0.022)；不同年齡組AOPP水平有顯著性差異(F=3.97

12、5,P=0.031)，其中不孕婦女年齡>35歲組AOPP水平最高，<30歲組最低。 【結(jié)論】 1．IVF-ET周期中，第一天胚胎培養(yǎng)液中存在蛋白氧化應(yīng)激現(xiàn)象。 2．ICSI周期中，第一天胚胎培養(yǎng)液中高水平的AOPP可能對早期胚胎發(fā)育和IVF結(jié)局造成不良影響。 3．常規(guī)IVF周期中，第一天胚胎培養(yǎng)液中高水平的AOPP雖然不影響早期胚胎發(fā)育，但對IVF結(jié)局造成不良影響。 第三章低溫冷凍和孵育對人精子氧

13、化應(yīng)激水平的影響 【目的】探討低溫冷凍和孵育對人精子氧化應(yīng)激水平的影響。 【方法】 1．標(biāo)本來源和分組：60例正常人精液標(biāo)本取自南方醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心因女性因素行試管嬰兒治療的男性患者。將每一例精液標(biāo)本，梯度離心法處理后，取得沉淀之精子，加人輸卵管培養(yǎng)液(human tubal fluid，HTF)，配制成精子密度在(20～30)×10<'6>/mL的懸液，取2.5 mL均分五份，分為五組，分別進行以下處理：A組為

14、處理前對照組，不進行低溫冷凍處理或孵育處理。B組為低溫冷凍空白實驗組，去除精子后的精子懸液進行低溫冷凍處理。C組為低溫冷凍樣本組，含精子的精子懸液進行低溫冷凍處理。D組為孵育空白實驗組，去除精子后的精子懸液進行孵育處理。E組為孵育樣本組，含精子的精子懸液進行孵育處理。 2．實驗方法：以AOPP作為蛋白氧化指標(biāo)，采用Vitko-Sarsat等介紹的方法進行測定。以丙二醛(malondialdebyde，MDA)作為脂質(zhì)過氧化指標(biāo)，

15、采用硫代巴比妥酸(thiobarbituri，TBA)比色法。 3．統(tǒng)計學(xué)方法：所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行分析，P<0.05為差異顯著。采用One-way ANOVA方差分析，AOPP水平的多重比較采用Tamhane’s T2方法，MDA水平的多重比較采用最小有意義差異(least significant difference，LSD)t檢驗方法。 【結(jié)果】 1．不同處

16、理組之間AOPP水平(F=19.994,P=0.000)和MDA水平(F=31.837,P=0.000)均有顯著性差異。 2．低溫冷凍樣本組MDA水平顯著高于處理前對照組(P=0.000)和低溫冷凍空白實驗組(P=0.000)，但AOPP水平無顯著性差異(P<,1>=0.663；P<,2>=0.829)。 3．孵育樣本組AOPP和MDA水平均顯著高于處理前對照組和孵育空白實驗組(AOPP：P<,1>=0.000；P<,2