牙髓卟啉單胞菌內(nèi)毒素誘導(dǎo)成骨細(xì)胞表達(dá)IL-1β mRNA和IL-6 mRNA及其相關(guān)信號通路的研究.pdf

1、目的：慢性根尖周病變的患牙根管為感染根管，其中牙髓卟啉單胞菌(Pe)幾乎只在感染根管內(nèi)出現(xiàn)，且檢出率較高，被認(rèn)為是牙髓感染的特有病原菌。在骨組織改建過程中，成骨細(xì)胞的生物學(xué)行為至關(guān)重要，它既可以分泌基質(zhì)形成骨組織，又可以產(chǎn)生炎癥因子，加速破骨細(xì)胞的骨吸收。本實(shí)驗(yàn)旨在研究p.e內(nèi)毒素(LPS)對成骨細(xì)胞表達(dá)白介素—1β(IL-1β)和白介素—6(IL—6)的影響，以及可能依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，探討p.e—LPS參與根尖周病變牙槽骨吸收的可能

2、病理機(jī)制，為臨床治療奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：①應(yīng)用腦心浸液(Brain heart infusion，BHI)固體培養(yǎng)基在37℃、厭氧條件(含80％N2、10％CO2、10％H2)下復(fù)蘇培養(yǎng)p.e，BHI液體培養(yǎng)基增菌后收集細(xì)菌，—20℃保存。②采用熱酚水方法提取p.e—LPS，應(yīng)用經(jīng)典的凝膠鱟試劑方法對所提取的內(nèi)毒素進(jìn)行定性分析。③MG63成骨細(xì)胞生長于含10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素的RPMI

3、1640培養(yǎng)基中，置于含5％CO2、37℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選擇生長狀態(tài)良好的第3、4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。④提取各組細(xì)胞的總RNA，應(yīng)用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain reaction，PCR)反應(yīng)擴(kuò)增IL-1β、IL—6和β—actin基因的表達(dá)，1.5％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，凝膠成像處理系統(tǒng)得到IL-1β、IL—6和β—actin的平均灰度值。⑤所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS11.0軟

4、件包建立數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行單因素方差分析和Dunnett-T檢驗(yàn)。顯著水平：P<0.05時(shí)有顯著性差異，P<0.01時(shí)有高度顯著性差異。 結(jié)果：⑴當(dāng)p.e—LPS濃度為0μg/ml時(shí)，MG63細(xì)胞表達(dá)少量IL—6 mRNA，不表達(dá)IL-1βmRNA，與0μg/ml組比較，1、5、10、20、50μg/ml組p.e—LPS誘導(dǎo)成骨細(xì)胞IL-1βmRNA和IL—6 mRNA的表達(dá)水平均有顯著提高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。⑵根據(jù)劑量

5、組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇10μg/ml的p.e—LPS分別作用于MG63細(xì)胞0、1、3、6、12、24h，隨著作用時(shí)間的增加，IL-1βmRNA和IL—6 mRNA的表達(dá)水平均顯著增加(P<0.01)。⑶ERK1/2激酶抑制劑PD98059預(yù)處理MG63細(xì)胞1h，p.e—LPS誘導(dǎo)的MG63細(xì)胞表達(dá)IL-1βmRNA水平下降。⑷p38 MAPK抑制劑SB203580預(yù)處理MG63細(xì)胞1h，p.e—LPS誘導(dǎo)的MG63細(xì)胞表達(dá)IL-1βmRNA和