大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后大腦皮層超微結(jié)構(gòu)改變及COX-4在神經(jīng)細(xì)胞能量代謝中的表達(dá)研究.pdf

1、蛛網(wǎng)膜下腔出血（Subarachnoid hemorrhage，SAH）多由動脈瘤破裂出血引起。腦血管痙攣（Cerebral vasospasm，CVS）是蛛網(wǎng)膜下腔出血常見和嚴(yán)重的并發(fā)癥，發(fā)生率高達(dá)70％，常引起嚴(yán)重的局部腦組織缺血或遲發(fā)性腦損傷，甚至導(dǎo)致腦梗死，成為致死或重殘的主要原因。目前普遍認(rèn)為SAH后血液彌散至蛛網(wǎng)膜下腔導(dǎo)致了腦血管痙攣和缺血性神經(jīng)功能的障礙，但是對SAH后神經(jīng)細(xì)胞的能量代謝及CVS的病理生理機(jī)制沒有完全研究清

2、楚。對于腦缺血機(jī)制的研究主要集中在大血管痙攣方面，但是這種腦血管痙攣不能完全解釋遲發(fā)性腦缺血的神經(jīng)功能障礙，大腦微動脈的障礙可能在SAH后的神經(jīng)細(xì)胞能量代謝和腦缺血中起了重要的作用。然而，SAH后大腦微循環(huán)的改變存在爭議。
　　 細(xì)胞色素C氧化酶調(diào)節(jié)亞基4（Cytochrome c oxidase4，COX-4）是線粒體呼吸鏈中的一個關(guān)鍵組成部分。COX-4是由nDNA編碼的調(diào)節(jié)亞基，它在10個由nDNA編碼的亞基中分子最大（M

3、W約17kD），是其中一個很重要的核編碼的亞單位，它們在胞漿中合成后輸入線粒體內(nèi)，與mtDNA編碼的亞基裝配形成全酶，COX-4具有COX4-1和COX4-2兩種異構(gòu)體，主要起到結(jié)合ATP，使細(xì)胞色素C氧化酶（Cytochrome c oxidase，COX）的活性在ATP/ADP比例升高時出現(xiàn)變構(gòu)性抑制，從而起到調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而對神經(jīng)細(xì)胞的能量代謝起到至關(guān)重要的作用。但是COX-4在蛛網(wǎng)膜下腔出血后神經(jīng)細(xì)胞的能量代謝中的表達(dá)鮮見報(bào)道。<

4、br>　　 目的：通過建立血管內(nèi)穿刺法大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，應(yīng)用光鏡和透射電鏡（transmission electron microscopy，TEM）觀察模型組不同時相的大腦皮層神經(jīng)元、線粒體及微血管的病理形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的變化特點(diǎn)，為研究SAH后神經(jīng)細(xì)胞的能量代謝及CVS的發(fā)生機(jī)制提供形態(tài)學(xué)資料。通過免疫組織化學(xué)染色觀察COX-4的在大鼠的SAH模型中的表達(dá)情況，探討COX-4在SAH后神經(jīng)細(xì)胞能量代謝中的表達(dá)規(guī)律，以及其表達(dá)

5、與形態(tài)學(xué)變化之間的關(guān)系，為臨床預(yù)防、緩解與治療SAH后CVS提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠66只，體重260-280g。隨機(jī)分為3組，正常組6只，假手術(shù)組6只，手術(shù)組45只，按造模時間再分為術(shù)后1h、3h、6h、9h、12h、24h、48h、5d、7d組共9組，每組各6只。手術(shù)組采用血管內(nèi)穿刺法制作SAH模型，假手術(shù)組僅做血管內(nèi)穿刺，不刺破大腦前動脈與大腦中動脈分叉。

6、
　　 2.各組動物麻醉后，經(jīng)左心室灌注多聚甲醛固定后取腦。觀察各組腦組織的大體形態(tài)，各組蛛網(wǎng)膜下腔血液分布情況。透射電鏡觀察線粒體、大腦皮層及微血管的超微結(jié)構(gòu)變化。
　　 3.免疫組織化學(xué)染色檢測SAH后神經(jīng)細(xì)胞中COX-4在蛋白水平的表達(dá)：免疫組化步驟按試劑盒說明進(jìn)行操作。在光學(xué)顯微鏡高倍鏡（10×40倍）視野下觀察陽性細(xì)胞。
　　 結(jié)果：
　　 1.腦組織大體觀手術(shù)組：術(shù)后1h-3h組可見頸動脈池、

7、視交叉池和基底池明顯積血，大腦凸面蛛網(wǎng)膜下腔少量積血。3h-24h組可見蛛網(wǎng)膜下腔的積血由腦底面向腦表面擴(kuò)散，大腦凸面蛛網(wǎng)膜下腔血液彌散范圍逐漸增大，24-48h組腦凸面及顱底面的蛛網(wǎng)膜下腔的血液較前減少，第四腦室可見明顯積血。5d組僅基底池可見少量血凝塊。7d組蛛網(wǎng)膜下腔的血液基本消失。正常組和假手術(shù)組開顱未見蛛網(wǎng)膜下腔有血液。
　　 2.大腦皮層及微血管的超微結(jié)構(gòu)觀察手術(shù)組：神經(jīng)元和血管內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)的改變主要是細(xì)胞核內(nèi)

8、染色質(zhì)邊集、濃縮，異染色質(zhì)增多，胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹、嵴紊亂、溶解呈空泡，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，脫顆?，F(xiàn)象。血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接消失，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)濃縮，線粒體腫脹、嵴紊亂，管腔狹窄甚至閉塞。在SAH后1 h時可發(fā)現(xiàn)超微結(jié)構(gòu)的改變，從6h開始明顯的結(jié)構(gòu)改變，在12h至48h結(jié)構(gòu)變化最明顯。正常對照組及假手術(shù)組：神經(jīng)元及血管內(nèi)皮細(xì)胞未見異常。
　　 3.COX-4蛋白在SAH后大鼠神經(jīng)細(xì)胞能量代謝中的表達(dá)手術(shù)組：于1h組開始大腦皮層神經(jīng)元

9、開始出現(xiàn)大量的COX-4的強(qiáng)陽性表達(dá)，并且達(dá)到高峰。與對照組比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此后表達(dá)開始降低，SAH后12h組的COX-4的陽性表達(dá)較SAH后1h組有所減少，但與對照組比較仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。降至24h后出現(xiàn)第一個最低點(diǎn)，而后又開始表達(dá)增強(qiáng)，到48h后又出現(xiàn)一個表達(dá)小高峰。隨后開始下降，直到7d組的COX-4的陽性表達(dá)與對照組比較差別無顯著性。假手術(shù)組與正常組偶見COX-4陽性表達(dá)，二者比較差別無顯著性。
　　 結(jié)論：