芪術(shù)顆?！盎鐾ńj(luò)”作用對(duì)肝竇毛細(xì)血管化影響的研究.pdf

1、本課題對(duì)肝纖維化“瘀血阻絡(luò)”病機(jī)理論進(jìn)行了探討,并對(duì)芪術(shù)顆?！盎鐾ńj(luò)”作用影響肝竇毛細(xì)血管化的機(jī)制進(jìn)行了研究。
　　 1理論研究部分
　　 通過對(duì)中醫(yī)學(xué)及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)肝纖維化相關(guān)文獻(xiàn)的整理分析,在課題組多年深入研究的基礎(chǔ)之上,對(duì)肝纖維化現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究概況、中醫(yī)學(xué)絡(luò)病理論在肝纖維化防治中的應(yīng)用及“化瘀通絡(luò)”在肝纖維化防治中的作用等方面進(jìn)行了初步的探討。
　　 依據(jù)絡(luò)病理論,肝纖維化的病位主要在肝絡(luò),是由濕熱疫毒、情志郁

2、結(jié)等諸多病因長(zhǎng)時(shí)間作用于肝臟及相關(guān)臟腑所導(dǎo)致的一種疾病。其病機(jī)主要是肝絡(luò)氣血運(yùn)行的異常,釀痰生瘀阻于肝絡(luò),致使其滲灌濡養(yǎng)肝體、疏通暢達(dá)氣血功能失常,“瘀血阻絡(luò)”是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的一個(gè)重要病機(jī)。所以在治療上,應(yīng)當(dāng)以“化瘀通絡(luò)”為一個(gè)治療重點(diǎn),結(jié)合病人整體情況,辨證施治。
　　 結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)肝纖維化的研究進(jìn)展,發(fā)現(xiàn)肝竇毛細(xì)血管化作為影響正常肝細(xì)胞和肝竇血液間的物質(zhì)交換的重要因素,在肝纖維化的發(fā)生及逆轉(zhuǎn)治療中起著重要的作用,

3、而肝竇毛細(xì)血管化又可歸屬于肝纖維化“瘀血阻絡(luò)”概念范疇,其可能是肝纖維化“瘀血阻絡(luò)”病機(jī)的重要內(nèi)容之一。
　　 2實(shí)驗(yàn)研究部分
　　 目的:觀察芪術(shù)顆粒對(duì)四氯化碳所致肝纖維化形成階段大鼠模型肝竇毛細(xì)血管化的干預(yù)作用,闡釋芪術(shù)顆?！盎鐾ńj(luò)”作用防治肝竇毛細(xì)血管化及肝纖維化的作用機(jī)制。
　　 方法:采用四氯化碳腹腔注射法復(fù)制肝纖維化形成階段模型大鼠,同時(shí)予芪術(shù)顆粒灌胃預(yù)防,并設(shè)立空白對(duì)照及模型對(duì)照組。分別于造模的第

4、4及第8周取大鼠肝臟組織,切取肝臟標(biāo)本約1mm3,迅速置入4℃2.5％戊二醛固定,經(jīng)鋨酸、環(huán)氧樹脂及醋酸鈾-檸檬酸鉛等固定、包埋、切片染色后,使用JEOL JEM-1400型透射電子顯微鏡觀察肝細(xì)胞、肝竇壁超微結(jié)構(gòu)及肝竇毛細(xì)血管化改變。同時(shí),取左外葉約2cm×1.5cm×0.5cm大小肝組織于10％甲醛溶液固定,行層粘連蛋白(LN)及Ⅳ型膠原(Co-Ⅳ)免疫組化染色制片,奧林巴斯IX70熒光倒置顯微鏡觀察切片黃染的深淺與面積,測(cè)定每張切

5、片黃染部分的累積光密度值(IOD),定量分析LN、Co-Ⅳ的在大鼠肝臟中的沉積情況。另外,取約200mg新鮮肝組織于-80℃液氮中保存,行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)各組大鼠肝臟血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)mRNA的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 1電鏡觀察結(jié)果
　　 空白對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞多為單核多角形,細(xì)胞核圓且多位于細(xì)胞中央?？梢姸喾N細(xì)胞器,數(shù)個(gè)細(xì)長(zhǎng)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊管聚在一起,平行排列。線粒體呈圓形或卵

6、圓形,基質(zhì)深暗,數(shù)量多,遍布細(xì)胞各處,嵴的數(shù)量中等。肝細(xì)胞內(nèi)?？梢娞窃：椭巍?nèi)皮細(xì)胞有窗孔,Disse間隙間可見由肝細(xì)胞向間隙內(nèi)凸起的微絨毛。
　　 模型對(duì)照組可見大量肝細(xì)胞凋亡,線粒體水腫,細(xì)胞器溶解,細(xì)胞呈空泡樣變,相鄰肝細(xì)胞間邊界不清、細(xì)胞連接消失。細(xì)胞胞核深染,胞質(zhì)濃縮,細(xì)胞內(nèi)糖原顆粒消失。毛細(xì)膽管腔擴(kuò)張,其內(nèi)微絨毛消失。形成毛細(xì)膽管的相鄰肝細(xì)胞的質(zhì)膜連接處的緊密連接結(jié)構(gòu)消失,膽汁滲入肝細(xì)胞胞漿內(nèi)。并且隨著造模時(shí)間的

7、延長(zhǎng),以上改變呈現(xiàn)出日益加重的情況。同時(shí)隨著造模時(shí)間的增長(zhǎng),肝竇內(nèi)皮細(xì)胞窗孔消失,內(nèi)皮細(xì)胞下形成連續(xù)基膜,肝竇管腔擴(kuò)張,Disse間隙變窄,細(xì)胞質(zhì)混沌不清。
　　 芪術(shù)顆粒組可見肝細(xì)胞再生活躍,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量增加,細(xì)胞器溶解消失,細(xì)胞間連接重現(xiàn)。8周組大鼠肝臟細(xì)胞較4周組細(xì)胞損傷嚴(yán)重,但其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量較4周組為多。4周及8周組大鼠毛細(xì)膽管內(nèi)微絨毛重現(xiàn),肝竇內(nèi)皮細(xì)胞窗孔重現(xiàn)。Disse間隙有所恢復(fù),但內(nèi)皮細(xì)胞下基膜仍存在?？傮w來看,以上

8、改變4周組較8周組大鼠為輕。
　　 2芪術(shù)顆粒對(duì)Ⅳ型膠原及層粘連蛋白的影響
　　 空白對(duì)照組LN在大鼠肝組織匯管區(qū)血管壁有少量分布,Co-Ⅳ則少量分布于靜脈、匯管區(qū)等部位,二者著色均為棕黃色。模型對(duì)照組及芪術(shù)顆粒組大鼠肝組織LN、Co-Ⅳ IOD值均較空白組有顯著增加(13.89±1.70vs1.61±0.65,15.92±1.96vs1.43±0.59；12.24±1.80vs1.33±0.56,17.82±2.94v

9、s1.48±0.33,P<0.01),且模型對(duì)照組大鼠肝組織LN、Co—Ⅳ表達(dá)IOD值隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)亦顯著增加(13.89±1.70vs15.92±1.96；12.24±1.80vs17.82±2.94,P<0.01)。芪術(shù)顆粒組大鼠肝組織LN、Co-Ⅳ IOD值較模型組顯著為低(8.15±2.01vs13.89±1.70,9.64±1.97vs15.92±1.96；7.32±2.11vs12.24±1.80,11.49±3.31v

10、s17.82±2.94,P<0.01),且隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng),芪術(shù)顆粒組大鼠肝組織LN及Co-ⅣIOD值增長(zhǎng)幅度均要較模型對(duì)照組為低(9.64±1.97vs8.15±2.01,11.49±3.31vs7.32±2.11)。
　　 3芪術(shù)顆粒對(duì)VEGF mRNA表達(dá)的影響
　　 模型對(duì)照組大鼠肝臟VEGF mRNA表達(dá)量在第4、8周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)較空白組均存在顯著的差異(0.33±0.02vs0.01±0.01,0.61±0.44

11、vs0.03±0.03,P<0.01)。芪術(shù)顆粒組大鼠肝組織VEGF mRNA表達(dá)量與模型對(duì)照組相比在第4周存在明顯降低(0.25±0.06vs0.33±0.02,P<0.05),第8周雖較模型對(duì)照組為低但未見顯著性差異(0.59±0.35vs0.61±0.44)。
　　 結(jié)論:
　　 1、芪術(shù)顆?？梢詼p輕四氯化碳對(duì)肝細(xì)胞的損傷作用,保護(hù)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整,促進(jìn)肝細(xì)胞修復(fù),減輕內(nèi)皮下連續(xù)基底膜的形成及內(nèi)皮細(xì)胞失窗孔的嚴(yán)重程